Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón

Maca, L., Ramírez, F.*

*Laboratorio de Bioquímica II, Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y de la Educación, Universidad del Cauca,
Popayán-Colombia.

RESUMEN: La capacidad reductora de los cloroplastos es una medida de confirmar el

mecanismo propuesto y aceptado de la fotosíntesis en general, también permite evaluar la
dependencia de este importante proceso en base a ciertos factores como la intensidad de luz
incidente y la longitud de onda de absorción. En esta sesión se evalúa la capacidad reductora de
cloroplastos aislados a partir de Spinacea oleracea (espinaca), además de que se determina la
influencia de la longitud de onda de absorción, concluyéndose que las longitudes de onda
cercanas o pertenecientes al color rojo son aquellas que permiten una mayor regularidad en la
reducción del 2,6-diclorofenolindofenol por acción de los cloroplastos aislados. También se
evaluó la eficiencia fotosintética mediante la cantidad de almidón detectado, tanto en los
cloroplastos ya aislados como en hojas enteras de geranio (familia Geraniaceae) y hojas de una
planta del género Spathiphylllium, con ayuda del ensayo con yodo, concluyéndose que los
cloroplastos aislados tuvieron mayor facilidad para sintetizar este compuesto que las hojas
completas; además, el factor que marcó una diferencia apreciable fue la intensidad de la luz
incidente, llegando a la conclusión que, a menor intensidad, menor producción de almidón. La
longitud de onda seleccionada no fue tan determinante en esta segunda sección.

INTRODUCCIÓN

Los organismos heterótrofos tenemos la oportunidad de subsistir gracias a la capacidad de ciertas

formas de vida de producir y almacenar sus propios recursos, usualmente llamado alimento;
dichas formas de vida son conocidas como organismos autótrofos [1]. Los organismos autótrofos
pueden clasificarse en quimiautótrofos, los cuales son capaces de utilizar la energía química
almacenada en compuestos inorgánicos (NO3-, NH4+, H2S) para transformar CO2 en
macromoléculas orgánicas, mientras que los fotoautótrofos utilizan energía radiante –usualmente
proveniente de la luz solar- para llevar a cabo el anterior proceso [2]. Los organismos
fotoautótrofos incluyen cianobacterias, bacterias azufrosas y no azufrosas, algunos protistas
flagelados, algas eucariotas y plantas, siendo estas últimas, los organismos más representativos
en el ejercicio de asociación de la fotosíntesis a la naturaleza [2].
El proceso por el cual los organismos fotoautótrofos sintetizan macromoléculas reducidas
(nutrientes), se denomina fotosíntesis, y este consiste básicamente en el aprovechamiento de
la radiación solar para promover la trasferencia electrónica desde compuestos donores de
electrones (H2O en la fotosíntesis oxigénica) y aprovechar la energía de los mismos para
posteriormente y con la ayuda de sistemas transportadores, obtener los nutrientes mencionados,
mayormente en forma de carbohidratos y aceites [2].
En las células eucariotas, la fotosíntesis se lleva a cabo en orgánulos especializados llamados
cloroplastos.
La estructura interna de los cloroplastos está generalmente dividida en dos secciones, el estroma,
definido como el especio que hay fuera de los tilacoides, pero delimitado por la membrana interna
del cloroplasto. Los tilacoides son sacos membranosos ubicados en el espacio interno del
cloroplasto, en los cuales se lleva a cabo la mayor parte del mecanismo fotosintético [2].
Los cloroplastos aislados, bajo las condiciones adecuadas, pueden tener aun capacidad
reductora, la cual se puede evaluar mediante la ayuda de un indicador que permita observar
cambios visibles contundentes ante los procesos de reducción que conlleva estar en la presencia

1
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

de cloroplastos “activos”. Este lo puede facilitar el 2,6-diclorofenolindofenol, compuesto

susceptible a reducirse y que experimenta cambios en la coloración o en la intensidad de la misma
que pueden ser seguidos mediante espectrofotometría.
Durante la presente sesión, se analiza la capacidad reductora de cloroplastos aislados
previamente observados en el microscopio y se verifica la presencia de almidón en hojas de
espinaca, bajo el supuesto de que, en condiciones aceptables, los cloroplastos contienen
cantidades suficientes del carbohidrato foto sintetizado.

METODOLOGÍA
Se realizaron 3 partes en el análisis de cloroplastos:
Capacidad reductora de cloroplastos: donde se escogió la parte tierna de hojas de espinaca
con ayuda de una tijera, así se recolectaron en total 76,0546 g de muestra para ser macerada
con arena a un baño de hielo. Posteriormente se le adicionaron 14 mL de tampón NaCl 2%/TRIS-
HCl 0,01 M; hasta que quedó una pasta homogénea, la cual fue filtrada y centrifugada no más de
250 rpm. En este momento se descartó el precipitado y el sobrenadante se volvió a centrifugar a
1500 rpm, para sedimentar los cloroplastos. Con los cloroplastos se realizaron mediciones
colorimétricas disolviendo primeramente una porción de cloroplastos:NaCl 0,15% (1:20 v/v) y lo
mismo en bicarbonato de sodio; obtenidas las dos suspensiones se prepararon los tubos de
ensayo recubiertos con papeles celofán de distintos colores como se muestra en la Figura 1, que
contenían la cantidad 0,1 mL de la suspensión de cloroplastos en distintos medios salinos y 4,5
mL de tampón 7,3. Terminada esta parte se procedió a realizar el montaje de iluminación usando
un bombillo de 100W como se muestra en la Figura 2; la longitud de onda de medición fue 650
nm y se ajustó el blanco con una suspensión de cloroplastos en medio tamponado pero sin
adición del indicador redox (2,6-diclorofenolindofenol). Listo lo anterior, se procedió a contabilizar
el tiempo después de adicionar 0,25 mL de 2,6-dicloroindofenol sódico a cada tubo de ensayo.
Las lecturas no se realizaron en un tiempo de espera constante, pero fue registrado.
Producción de almidón en plantas verdes por efecto de la luz: se emplearon dos materas:
una, la planta de geranio (de la familia Geraniaceae) y otra del género Spathiphylllium, ambas
plantas de jardín y ninguna desarrolla fruto (Figura 3). Desde el día anterior fueron recubiertas
algunas hojas con papel aluminio y otras con papel celofán de diferentes colores, y recibieron la
luz directa del sol aproximadamente de 6 a 12 horas; luego fueron cubiertas con una bolsa de
color negro y en la mañana fueron retiradas de la matera, posteriormente se les realizaron
estudios de producción de almidón con la adición de triyoduro. Después de un baño maría con
etanol, debido a la dificultad para ver resultados se decidió realizar cortes en las hojas y sobre
estos adicionar el triyoduro, así se realizó con todas las hojas.
Producción de almidón en cloroplastos aislados: para esta parte se utilizaron 4 mL de
cloroplastos aislados anteriormente disueltos en 18mL de tampón 7,3; posteriormente, 2 mL de
bicarbonato de sodio 0,05M, 15 mL de etanol y 3 gotas de triyoduro fueron adicionados. Este
conjunto fue expuesto a una fuente directa de luz solar envuelto en papel aluminio por un tiempo
aproximado de una hora, al cabo de este tiempo se disolvió en etanol hirviendo y posteriormente
se filtró, adicionándole a este unas gotas de triyoduro para determinar almidón. Así mismo se
repitió el experimento base con envolturas de papel celofán verde y amarillo.

Figura 1. Tubos de ensayo envueltos en papeles de distintos colores.

2
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Figura 2. Montaje experimental para la determinación de la capacidad reductora de cloroplastos

aislados.

Figura 3. Tratamiento previo para hojas de planta de geranio (derecha) y planta del género
Spathiphylllium (izquierda y central).

RESULTADOS Y ANÁLISIS
En el Anexo 1 se muestran los datos recolectados para las mediciones de el avance de la
reducción del 2,6-diclorofenolindofenol. La ecuación química mediante la cual se describe el
proceso se presenta en el Esquema 1.

Esquema 1. Reacción Redox entre el indicador (2,6-diclorofenolindofenol) y el agua, actuando

esta última especie como donor de electrones en presencia de cloroplastos aislados [3], [4], [5].

Se ejemplifica a el agua como donor de electrones ya que es el medio de la reacción en

suspensión.

3
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

La reacción del Esquema x representa de forma simplificada la reacción de fotólisis del agua de
que se da como fase previa a la fotosíntesis. Los cloroplastos son conocidos por la capacidad
que poseen de favorecer la evolución de oxígeno en presencia de un aceptor de electrones,
usualmente distinto del CO2. Esta capacidad reductora de los cloroplastos aislados fue
comprobada por primera vez en 1937 por Robert Hill, dando origen al nombre de la reacción
(reacción de Hill), al demostrar que incidiendo radiación en cloroplastos aislados, se favorecía la
reducción de una especie aceptora de electrones, con una simultánea liberación de oxigeno [4];
por varios años, se aceptó como la única actividad foto catalítica y fotoquímica en general que
poseían los cloroplastos aislados, y hasta mediados de la década de 1950’s, se conocía entonces
como la “reacción de los cloroplastos” [5].
La reacción de Hill puede ser descrita de forma general mediante la Ecuación 1, en donde A
representa, en este caso, al 2,6-diclorofenolindofenol [5].

La evaluación de la capacidad reductora de los cloroplastos es simplemente evaluada entonces

por la disminución en la absorbancia del indicador Redox; a medida que avanza la reacción (t se
hace mayor), se espera que la absorbancia disminuya, debido al consumo del indicador para
producir la forma reducida 2,6-dicloro-4-((4-hidroxifenil)amino)fenol (Esquema 1).
El estudio de la capacidad reductora de los cloroplastos aislados se llevó a cabo en dos medios
salinos distintos: NaCl y NaHCO3. De forma general, se pueden analizar los efectos y
necesidades de tener los cloroplastos en cada uno de estos medios. El NaCl permite regular la
osmolaridad de la solución o medio en el que los cloroplastos se encuentran. Cuando la
osmolaridad es lo suficientemente alta, tal que se produzca estrés osmótico en los cloroplastos,
se genera una inhibición del proceso de reducción, es decir, la capacidad reductora disminuye
ante la incapacidad del orgánulo de actuar como transportador de electrones entre el donor y el
aceptor, esto debido seguramente a la lisis de la membrana doble principalmente, desacoplando
así la cadena trasportadora de electrones [6], [7], [8]. Antes de la preparación de la suspensión
final para la evaluación de la capacidad reductora mediante medición espectrofotométrica, los
cloroplastos aislados se suspendieron en una solución de NaCl 0,15% en una proporción 1:20 de
cloroplastos:NaCl; la osmolaridad aproximada del medio es 0,051 M, osmolaridad que no
aparenta perjudicar la capacidad reductora de los cloroplastos [6], [8].
El NaHCO3 puede tener un efecto osmo-regulador, aunque menor que el NaCl, ya que, en
solución acuosa, el ion bicarbonato puede formar ácido carbónico que a su vez se puede
descomponer en CO2. Esta secuencia de reacciones químicas disminuye la osmolaridad de una
solución de NaHCO3 respecto a una de NaCl de la misma concentración formal. Sin embargo, la
concentración de la solución de bicarbonato usada es aproximadamente el doble que la de NaCl,
por lo que se puede, de cierto modo, compensar la disminución de la osmolaridad por el efecto
mencionado. Además de lo anterior, el NaHCO3 genera CO2 en solución acuosa, el cual actúa
como aceptor de electrones en la cadena de transporte del cloroplasto (provenientes de otro
aceptor primerio de electrones distinto al indicador, como puede ser el NADP+) en caso de estar
presente, por lo cual se podría inferir un resultado aparentemente falso de disminución de
capacidad reductora de los cloroplastos que, aun realizando la reacción como se muestra en la
Ecuación 1, al ser el CO2 el aceptor de electrones, no se ve disminuida la absorbancia del
indicador.
En la Figura 4 se muestran los resultados de la medición espectrofotométrica de la capacidad
reductora de cloroplastos aislados de Spinacea oleracea en ambos medios salinos.

4
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Capacidad reductora
2,5

2
Absorbancia

1,5

NaCl
1
Bicarbonato

0,5

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (s)

Figura 4. Medición de la capacidad reductora de cloroplastos aislados en medios salinos

distintos.

Independientemente del medio salino, se observa una decadencia en las absorbancias medidas,
y en ambos casos hay un aumento alrededor de la mitad del experimento, en el cual hay una
subida de absorbancia, y posteriormente disminuye de nuevo.
Esto puede ser debido a que la reacción de reducción del indicador sea reversible bajo las
condiciones dadas, lo cual causaría un aumento en la absorbancia por la regeneración de la
forma oxidada del indicador, aunque posteriormente este disminuye nuevamente. Los resultados
mostrados permiten comprobar que, sin importar el medio salino, aparentemente la capacidad
reductora de los cloroplastos no fue inhibida y la reducción del indicador transcurrió de forma
regular, hablando de forma simple. La osmolaridad no parece disminuir de forma significativa la
reducción del indicador y en medio carbonatado, la reducción parece deberse a la presencia de
2,6-diclorofenolindofenol como aceptor de electrones, imponiéndose a la posible presencia de
CO2. Si debieran mencionarse errores concernientes a la medición espectrofotométrica, se
deberían entonces aclarar los aportes que pueden tener las suspensiones de cada tubo de
ensayo en la medición. A pesar de la realización de un blanco, como se menciona en la sección
de Metodología, el transvasar cada vez que se iba a medir un sistema pudo haber cambiado las
condiciones físicas de la suspensión, desviando de maneras distintas las absorbancias,
ocasionando la posible obtención de resultados como el mostrado en la Figura 4, en medio salino
de bicarbonato de sodio.
En las Figuras 5-9 se muestras los resultados de las mediciones espectrofotométricas de los
sistemas en suspensión de cloroplastos en ambos medios salinos con diferentes filtros de
absorción consistentes en la envoltura de los tubos de ensayo con papel celofán de distintos
colores.

5
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Capacidad reductora-filtro rojo

2
1,8
1,6
1,4
Absorbancia

1,2
1
NaCl
0,8
Bicarbonato
0,6
0,4
0,2
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (s)

Figura 5. Resultados medición capacidad reductora con filtro de papel color rojo.
Capacidad reductora-filtro verde
2
1,8
1,6
1,4
Absorbancia

1,2
1
NaCl
0,8
Bicarbonato
0,6
0,4
0,2
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (s)

Figura 6. Resultados medición capacidad reductora con filtro de papel color verde.

6
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Capacidad reductora-filtro amarillo

2,5

2
Absorbancia

1,5

Series2
1
Series1

0,5

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (s)

Figura 7. Resultados medición capacidad reductora con filtro de papel color amarillo.

Capacidad reductora-filtro color azul

1,9

1,85

1,8
Absorbancia

1,75
NaCl
1,7 Bicarbonato

1,65

1,6
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (s)

Figura 8. Resultados medición capacidad reductora con filtro de papel color azul.

7
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Capacidad reductora-papel aluminio

2
1,8
1,6
1,4
Absorbancia

1,2
1
NaCl
0,8
Bicarbonato
0,6
0,4
0,2
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (s)

Figura 9. Resultados medición capacidad reductora con papel aluminio.

Los trozos de papel celofán usados como recubrimiento de los tubos de ensayo en los distintos
experimentos se pueden asemejar a filtros de absorción usados en equipos de espectroscopia.
Los filtros de absorción son materiales colorados que permiten seleccionar longitudes de onda
con anchos de banda de entre 30 y 250 nm, por lo cual la precisión que se tiene con ellos es
mucho menor que cuando se usan filtros de interferencia, por ejemplo. Los filtros de absorción
suelen tener transmitancias muy bajas, perdiéndose gran parte de la intensidad de la radiación
necesaria para las medidas espectrofotométricas [9].
Teniendo en cuenta que este papel no es diseñado con el fin de servir como filtro absorción, se
puede entonces analizar el efecto de cada uno de los selectores de longitud de onda que se
usaron.
La capacidad reductora de los cloroplastos es básicamente explicada a través de la fotosíntesis.
Una vez se ha realizado la fotólisis del agua y el PS II ha trabajado en conjunto para recibir y
trasportar los electrones provenientes de dicha oxidación, a parte de la evolución de oxígeno, se
desencadena el transporte electrónico que desemboca en la donación de los electrones “del
agua” en un inicio, a un aceptor primario de electrones. El aceptor primario de electrones suele
ser el NADP+, que puede seguir siéndolo en este caso, o también podría pasar a ser el indicador
Redox. Cualquiera sea el caso, el NADPH formado podría transferir aun esos electrones al
indicador Redox. Habiendo recordado el funcionamiento muy superficial de la etapa luminosa de
la fotosíntesis, se debe mencionar que los fotosistemas I y II que trabajan en el transporte
electrónico dependen de la absorción de radiación mayormente de la región del rojo (700 y 680
nm, respectivamente), y por lo tanto se espera que, el experimento con mayor representatividad
de lo que debería ocurrir será aquel que utilice un filtro rojo (Figura 5). De todas las gráficas
homologas presentadas (Figuras 4-9) se puede observar que aquella que presenta una
distribución de datos más regular y acorde a lo esperado es la que representa los resultados
obtenidos con el papel celofán rojo, permitiendo inferir que, aunque los anchos de banda de estos
materiales no suelen ser muy precisos, como ya se dijo, la utilización de este color de papel
permite enfocar la absorción en longitudes de onda cercanas a las requeridas por los
fotosistemas.
Por otro lado, los fotosistemas se componen mayormente de clorofilas a y b y carotenos, los
cuales poseen bandas de absorción entre 400 y 500 nm (además de las bandas alrededor de 650

8
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

que poseen las clorofilas), lo cual podría permitir que los fotosistemas trabajaran de forma
irregular impulsados por las absorciones que puedan tener sus constituyentes a dichas longitudes
de onda menores [10]. Lo anterior podría verse reflejado con la utilización de los filtros verde y
azul; de hecho, la Figura 8 (filtro azul) es la que muestra una mayor irregularidad, sobre todo en
medio bicarbonato de sodio. La Figura 6 también muestra cierta irregularidad en las primeras
secciones de la representación de cada medio salino, aunque no son tan prominentes como en
la gráfica del filtro azul.
La Figura 7 muestra los resultados para los sistemas usando filtro color amarillo, y se muestra
cierta regularidad en medio NaCl, pero en bicarbonato se vuelve a presentar un comportamiento
similar al de otras gráficas. A pesar de que ciertos pigmentos contenidos en los tilacoides de los
cloroplastos tienen bandas de absorción que cruzan entre las longitudes de onda pertenecientes
al color amarillo, no son tan prominentes como las principales, por lo cual la reducción en la
absorbancia puede ser debida a procesos inherentes de reducción del indicador Redox, o a la
absorción de radiación por incidencia directa sobre la suspensión de cloroplastos.
En general se observa que en medio salino NaCl, la disminución de absorbancia tiene un
comportamiento más regular y acorde a lo esperado, con algunas desviaciones tal vez debidas a
la reversibilidad de la reacción de reducción del 2,6-diclorofenolindofenol. El medio bicarbonato
pudo tener menor incidencia en la regularidad tal vez debido a la formación de dióxido de carbono
y posterior fijación del mismo por parte de los cloroplastos, o simplemente por burbujeo del mismo
hacia el exterior de la suspensión. Otro detalle importante que se denota en las gráficas y que
puede ser una explicación a los comportamientos en cada medio es que, como se observa en el
eje de las abscisas y a causa de la metodología de toma de muestra empleada, las muestras en
medio NaHCO3 se sometieron a la medición espectrofotométrica varios minutos después de
hacerlo con las muestras en medio NaCl, lo cual pudo ocasionar que se midiera la reacción a
velocidades mucho más lentas, cuyos avances se hayan dado en la primera parte de la medición.
Esto le genera mayor sentido a la hipótesis de la reversibilidad de la reacción, escenario en el
cual es más probable pensar en dicho fenómeno, debido a que ya se ha establecido, o está más
cerca de establecerse el equilibrio de la reacción.
Aunque los cloroplastos pueden llevar a cabo la reacción de Hill como ya se ha discutido, estas
no son las únicas reacciones que pueden llevar a cabo los orgánulos aislados. Arnon et.al.
postulan y demuestran en 1956, que los cloroplastos aislados pueden llevar a cabo otras
reacciones que, hasta unos pocos años antes de 1956, se pensaba solamente podían ocurrir
estando estos en la planta [5].
En la Figura 10 se muestran los resultados de los experimentos para la verificación de la
presencia de almidón en cloroplastos aislados de Spinacea oleracea.

a b

Figura 10. Resultados de la confirmación de producción y presencia de almidón el cloroplastos

aislados y sometidos a 1 hora de sol bajo envoltura de papel a) aluminio, b) celofán color verde
y c) celofán color amarillo.

9
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

Se observa que, con justa razón, el sistema con menor cantidad del almidón (aparición de
coloración azul en forma de gránulos muy pequeños) es aquel que ha sido cubierto con papel
aluminio. El papel aluminio, en teoría, debería impedir el paso por completo de la radiación. Sin
embargo, se observa en la Figura 10a que hay una pequeña cantidad de almidón, suficiente como
para inducir la coloración azul ante la presencia de yodo. Esto indica que, aunque se reduce
notablemente la intensidad de radiación (factor del cual depende la eficiencia fotosintética), los
cloroplastos aislados muestran aun la capacidad de poder fijar CO2 tal vez haciendo uso de la
poca intensidad lumínica a la cual tenían acceso, considerando que puede ser posible ya que,
estando aislados, los cloroplastos podrían tener una mayor sensibilidad a la absorción de luz que
estando en hojas de las plantas.
Los cloroplastos aislados sometidos a envoltura de papel celofán (Figura 10 b y c) evidencian una
mayor presencia de almidón, aunque es difícil identificar cuál de las dos es más prominente.
Como se discutió anteriormente, las longitudes de onda entre los colores verde y amarillo no
incluyen aquellas en las cuales se realiza la absorción máxima de los fotosistemas I y II; sin
embargo, estas longitudes de onda abarcan algunas de las bandas de absorción de los pigmentos
más importantes presentes en los cloroplastos [10], por lo cual no es incoherente que bajo la
acción de filtros de absorción verdes y amarillos se puedan dar las reacciones que, bajo una
concentración suficiente de CO2 –posiblemente obtenido del ion bicarbonato, como ya se
mencionó anteriormente- lleven a los cloroplastos a producir almidón. Como postulan Arnon et.al
en 1956 [5], los cloroplastos aislados poseen aun la capacidad de llevar a cabo las reacciones
fotosintéticas más importantes para la producción de almidón: fotolisis del agua, fotofosforilación
oxidativa y fijación de CO2. La polimerización de monómeros de glucosa se lleva a cabo por
enzimas posteriormente al proceso glucosintético [11], lo cual hace este proceso independiente
de la radiación.
En la Figura 11 se muestran los resultados de la determinación de la presencia de almidón en
hojas completas sometidas envoltura con diferentes tipos de papel durante un día.

a b

c d

e f

Figura 11. a) Resultado del ensayo con yodo para la determinación de almidón en una hoja de
geranio (especie de la familia Geraniaceae) sometida al sol. b) Ensayo con yodo para una hoja
de una planta del género Spathiphyllum. c) Comparación entre los resultados mostrados en a y
en b. d) Resultado del ensayo con yodo para la determinación de almidón en hoja de geranio
sometida al sol envuelta en papel aluminio. e) Hoja de Spathiphyllum sometida al sol envuelta
en papel celofán amarillo. f) Resultado de hoja de geranio ante la prueba con yodo, en solución,
para aquella muestra sometida a la irradiación solar envuelta en papel celofán azul.

10
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

En general fue muy difícil poder observar cambios en la coloración, tanto de las hojas enteras (ya
fueran aquellas sometidas al sol directamente, envueltas en papel aluminio o celofán) como de
los extractos y soluciones de tratamiento de la muestra. De las dos pruebas en las cuales se
examina la presencia de almidón, o más precisamente, la capacidad de sintetizarlo, la diferencia
más evidente es la intensidad de la coloración producida por la formación del complejo almidón-
yodo. Esta diferencia, como se dijo, puede ser debido a que como quiera que sean las
condiciones de reacción, los cloroplastos aislados tienen una mayor efectividad a la hora de
absorber la radiación, debido a que están directamente expuestos a la luz solar sin la irrupción
del tejido vegetal de las hojas. Como ya se mencionó brevemente, la intensidad de la radiación
es uno de los factores que determina la eficiencia fotosintética, la cual se puede medir de cierta
forma en la cantidad de almidón sintetizado.
A diferencia de los cloroplastos aislados, las hojas no estaban inmersas en un medio que
permitiera una obtención alternativa de CO2, como el bicarbonato de sodio; las hojas fueron
sometidas a una envoltura en distintos tipos de papel, por lo cual la absorción de la radiación no
fue optima con seguridad, siendo este uno de los posibles factores de diferenciación en la síntesis
de almidón entre los cloroplastos aislados y hojas enteras.
La biosíntesis y almacenamiento de almidón puede ser regulada alostéricamente. La enzima
ADP-glucosa fosforilasa (ADPGasa) es la enzima que da inicio al proceso de síntesis de almidón
[12]. Se ha demostrado que esta enzima está alostéricamente regulada por una alta
concentración del ion ortofosfato en la planta [11], por lo cual, el estado de desarrollo del material
vegetal de origen pudo ser una causa de disminución en la cantidad de almidón sintetizado al
momento del ensayo con yodo.
El estado de descomposición que pudo haber tenido la planta al momento de la medición pudo
ser causante de la baja cantidad de almidón hallada, además de la evidente disminución de la
intensidad lumínica incidente sobre las hojas debido a las envolturas de papel.

CONCLUSIONES

Se logró determinar el efecto de la intensidad de la luz incidente sobre los fotosistemas de

cloroplastos aislados, con una clara disminución en la cantidad de almidón presente cuando se
tenía menor intensidad de luz incidente (papel aluminio), determinada por la intensidad del color
del complejo de este polisacárido con yodo. En hojas completas fue mucho menos evidente el
efecto de la intensidad de la luz ya que en todas se dificultó mucho la visualización de la formación
del complejo con yodo, atribuida esta diferencia principalmente a la diferencia de sensibilidad que
tienen los cloroplastos al estar aislados y aun en las plantas, además de la probable inhibición
alostérica de la ADPGasa, lo cual depende del estado de desarrollo de la planta.
Se logró comprobar el efecto de la longitud de onda incidente sobre los cloroplastos aislados en
la capacidad reductora de los mismos, mediante la medición espectrofotométrica de la variación
de la concentración de 2,6-diclorofenolindofenol respecto al tiempo, obteniéndose en general
relaciones inversas entre la absorbancia y el avance de la reacción de Hill. Las gráficas realizadas
para las mediciones espectrométricas del indicador muestran que el filtro rojo es aquel que
permite una mayor regularidad cualitativa en la disminución de absorbancia respecto al tiempo,
ya que a longitudes de onda cercanas a 700 nm es en las cuales absorben los fotosistemas I y
II. El efecto de la longitud de onda de absorción fue más difícil de diferenciar en la producción de
almidón de cloroplastos aislados, probablemente porque a longitudes de onda intermedias y bajas
(medidas respecto al espectro visible 400-700 nm) algunos pigmentos importantes de los
tilacoides aun presentan bandas de absorción significativas, lo cual favorece la biosíntesis de
almidón.
La absorción de luz y síntesis de almidón en cloroplastos aislados aparenta ser más efectiva que
en hojas completas, probablemente debido a que se tiene una mayor sensibilidad ante la

11
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

captación de luz y de CO2; además, al estar en la planta, el estado de desarrollo de la misma es

casi que un regulador alostérico enorme del cual depende la actividad de los cloroplastos,
mientras que aislados, estos pueden “regular su propio metabolismo”.

REFERENCIAS

[1] C. M. M. Nelson L. D., LEHNINGER Principles of Biochemistry 8th ed. United States of
America: Macmillan Learning, 2021, p. 4380.
[2] G. Karp, Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos, 4th ed. McGraw-Hill,
2006, p. 748.
[3] M. F. Rosa, A. M. Rosa, R. A. Sversut, M. S. do Amaral, and N. M. J. R. C. d. C. Q.-F.
Kassab, "Avaliação do teor de vitamina C de preparados sólidos para refresco
comercializados em Campo Grande-MS," vol. 47, no. 3, pp. 339-349, 2018.
[4] J. Fernandez and C. Sancho, "Comparative study of the inhibition produced by CMU (3-p-
chlorophenyl-1. 1-dimethyl-urea) in barley leaves, on the photophosphorilation,
photocarboxilation and hill reaction," Junta de Energia Nuclear (JEN)1977.
[5] D. I. Arnon, M. Allen, and F. J. B. B. A. Whatley, "Photosynthesis by isolated chloroplasts.
IV. General concept and comparison of three photochemical reactions," vol. 20, 1956.
[6] G. A. Berkowitz and M. J. P. P. Gibbs, "Effect of osmotic stress on photosynthesis studied
with the isolated spinach chloroplast: generation and use of reducing power," vol. 70, no.
4, pp. 1143-1148, 1982.
[7] a. D A Walker and A. R. Crofts, "Photosynthesis," vol. 39, no. 1, pp. 389-428, 1970.
[8] M. Schönfeld, M. Rahat, and J. J. P. P. Neumann, "Photosynthetic Reactions in the Marine
Alga Codium vermilara: I. CO2 Fixation and Hill Reaction in Isolated Chloroplasts," vol. 52,
no. 3, pp. 283-287, 1973.
[9] D. A. Skoog, J. F. Holler, and S. R. Crouch, Principios de análisis instrumental (Sexta), 6th
ed. Cengage Learning, 2008.
[10] J. A. Knopp and C. Hardin, C., Biochemistry Essential Concepts. Nueva York, USA: Oxford
University Press, 2013, p. 297.
[11] A. J. A. A. Tofiño, "Regulación de la biosíntesis del almidón en plantas terrestres:
perspectivas de modificación," vol. 55, no. 1, pp. 1-13, 2006.
[12] A. Barranco Aguilar, "Dinámica de carbohidratos y mecanismos de regulación de la ADP-
Glucosa pirofosforilasa durante el desarrollo de fruto de plátano macho (Musa paradisiaca
L)," Maestría en Ciencias en Desarrollo de productos Bióticos, CENTRO DE
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS, INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL,
Yautepe, Morelos, México, B120182, 2014.

12
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.
Informe de Laboratorio de Bioquímica II Grupo B

ANEXO 1: Resultados de la medición espectrofotométrica de la capacidad reductora de

cloroplastos aislados.

Tabla A1. Medio NaCl.

SIN PAPEL ROJO AMARILLO VERDE AZUL ALUMINIO
t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A
79 1,8812 122 1,8648 167 1,9146 220 1,2641 252 1,7179 297 1,7426
345 1,7687 342 1,7456 422 1,7549 472 1,7466 511 1,7919 549 1,7549
605 1,576 597 1,6647 677 1,7518 737 1,7719 776 1,7426 817 1,7141
861 1,6803 847 1,6464 919 1,7094 947 1,7198 1003 1,7112 1039 1,6838
1075 1,6344 1074 1,5264 1153 1,6733 1182 1,6336 1223 1,6973 1284 1,5618
1316 1,5973 1312 1,4989 1399 1,5973 1460 1,6344 1498 1,6473 1551 1,5538

Tabla A2. Medio NaHCO3.

SIN PAPEL ROJO AMARILLO VERDE AZUL ALUMINIO
t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A
1871 1,8971 1887 1,8257 1916 1,2481 1953 1,6569 1979 1,8614 2014 1,0894
2071 1,8614 2080 1,7156 2109 1,7952 2134 1,7644 2161 1,7778 2193 1,7917
2226 2,0732 2253 1,6862 2279 1,7677 2308 1,7049 2331 1,8308 2374 1,7633
2403 1,7546 2427 1,627 2459 1,6917 2491 1,6954 2554 1,7127 2548 1,7117

13
Práctica 4 – Capacidad reductora de cloroplastos aislados y biosíntesis fotosintética de almidón.