Determinacin cuantitativa de protenas solubles por el mtodo de biuret

ngela Ruiz, Anglica Quiroz & Carlos Maje

Estudiantes Del V semestre de Ingeniera De Alimentos
Docente: Yudi Silva
Universidad De La Amazonia Avd. Circunvalar, Barrio Porvenir
Florencia -Caquet
Bioqumica
Abril 2015
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Resumen: Para el estudio de la estructura de una protena, de la actividad de una enzima o el contenido
protenico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentracin de las protenas por tal razn
en esta prctica se utiliz el mtodo de Biuret con el objetivo de conocer la concentracin de protena contenida
en la clara de huevo, donde se realizo una curva estndar, al despejar la ecuacin la curva se obtuvo 130,14mg/
ml de albumina y en porcentaje se obtuvo 13%.

Palabras

claves: cuantificacin de protenas, Biuret, curva patrn,

espectrofotometra.

Introduccin
Estimar la concentracin de protena es necesario no
solo en los laboratorios de investigacin, sino
tambin en la industria alimenticia, farmacutica, y
biotecnolgica en general. Existen muchos mtodos
para la determinacin de protenas. Primitivamente,
la cantidad de protenas se evaluaba midiendo la
cantidad total de nitrgeno proteico, y teniendo en
cuenta
que
este
elemento
representa
aproximadamente el 16% del peso de una protena.
Este era un mtodo largo y laborioso y con poca
sensibilidad. La aparicin de mtodos calorimtricos
ha permitido solventar estos dos inconvenientes.
(Arellano & Duhalt, s.f)
Entre los mtodos que se basan en la formacin de
complejos colorimtricos entre las protenas y
reactivos especficos se encuentran: el mtodo de
Biuret, el mtodo de Lowry y el mtodo de Bradford.

Tomado de: MANUAL PRCTICAS

LABORATORIO DE BIOQUMICA

DE

Los tres mtodos tienen como principio alguna

reaccin qumica de los grupos alquilo o arilo de los
diferentes aminocidos.

Materiales y mtodos
Los materiales utilizados en esta prctica fueron: 8
tubos de ensayo, una gradilla, un beaker, un agitador
el espectrofotmetro, dos pipetas.
Reactivos: solucin de albumina de huevo, reactivo
de Biuret, NaCl.

El mtodo de Biuret es la tcnica ms simple para la

determinacin de protenas solubles, las sustancias
que contienen dos o ms enlaces peptdicos forman
un complejo purpura-violeta con sales de cobre (II)
alcalinas (figura 1). Es posible que el color se forme
por la formacin de un ion coordinado, tetracuprico,
con dos grupos amida adyacentes. El desarrollo del
color es diferente para cada protena y su intensidad
se puede determinar espectroscpicamente a 540nm.
La cuantificacin de la protena se lleva acabo con
una curva patrn, el principio establecido por la ley
de Lambert Beer. Existen pocas interferencias en
esta determinacin; entre ellas, la presencia del ion
amonio altera el desarrollo del color; algunos
pigmentos absorben a la misma longitud de onda,
algunos lpidos y carbohidratos son capaces de
formar complejos con el ion coordinado. (Bolaos,
Giselle, & Herrera, 2003)

La prueba consisti en: primero, en preparar la

muestra con solucin de albumina de huevo, luego se
rotularon 9 tubos de ensayo y se procedi de la
siguiente manera:
Un tubo se rotulo como blanco, y el resto se rotularon
con nmeros de 1 al 8; al tubo rotulado como blanco
se le agrego 2.0 ml de agua y 4.0 ml del reactiv de
biuret, al tubo 1 se la agrego, 0.2 ml de patrn de
albumina, 1,8 ml de agua y 4.0 del reactiv de biuret,
al tubo 2 se le agrego 0.4 ml de patrn de albumina,
1.6 ml de agua y 4.0 del reactiv de biuret, al tubo 3
se le agrego 0.6 ml de patrn de albumina, 1,4 ml de
agua y 4.0 del reactiv de biuret, al tubo 4 se le
agrego 0.8 ml de patrn de albumina, 1,2 ml de agua
y 4.0 del reactiv de biuret, al tubo 5 se le agrego 1.0
ml de patrn de albumina, 0,5 ml de muestra, 1,5 ml
de agua y 4.0 del reactiv de biuret, al tubo 6 se le
agrego 0.5 ml de muestra, 1.5 ml de agua y 4.0 del
reactiv de biuret, al tubo 7 se le agrego 1.0 ml de
muestra, 1.0 ml de agua y 4.0 ml del reactiv de
biuret y al tubo 8 se le agrego 0.3 ml de muestra, 1,7
ml de agua y 4.0 del reactiv de biuret.
Despus de tener todos los tubos con la solucin se
colocaron en reposo por 30 minutos en una parte
oscura. Al trmino del tiempo se realiz la
cuantificacin de la solucin por medio de un
espectrofotmetro a 540 nm de los tubos, entre cada
medicin se lavaban las celdas; al tener todas las
mediciones se dispuso a realizar la curva de
calibracin.

El espectrofotmetro que se va a manejar en la

prctica es del tipo convencional de haz simple. Un
esquema del mismo se presenta a continuacin:

Resultados y Clculos
Figura 3: tubos de ensayo despus de agregarle
patrn de albumina, muestra, agua y reactivo de
Biuret.

Figura 2: Esquema de
convencional de haz simple

un

espectrofotmetro

El objetivos a realizar en esta prctica es determinar

el porcentaje de albumina obtenida en la clara de
huevo por el mtodo de biuret.

Clculos para determinar

tubo 8:

la concentracin del

TABLA 2:
Resultados
Obtenidos Del
Espectrofotmetro Y Clculos De La Concentracin
De Albumina
TUBOS

Absorbancia

0.135

0.167

0.163

0.330

0.200

0.500

0.238

0.667

0.273

0.833

[ Mg/Ml Albumina ]

Tubo de la muestra a determinar la concentracin de

albumina :
8

0.249

Convertir los mg a gramos

130,14

Los tubos 6 y 7 se omitieron debido a que los

resultados arrojados por el espectrofotmetro estn
por fuera de los rangos de los tubos 1 al 5

Regla de tres simple para saber cuntos gramos

hay en 100 ml.
1 ml
X

100 ml

Ahora si determinamos del porcentaje peso/

volumen de la concentracin de albumina en el
tubo 8

4. mencione cual es la razn de que el mtodo de

biuret la absorbancia de una protena se lea a una
longitud de 540nm.

Discusin de los resultados

Cuando se determin la absorbancia por medio del
espectrofotmetro de los diferentes tubos del 1 al 5
(vase tabla 2) se observa que la absorbancia va
aumentado de tubo en tubo, y esto es debido a que la
intensidad del color de la reaccin es proporcional a
la cantidad de protena en la muestra. Esto se observ
claramente en la coloracin de las soluciones (vase
figura 3), el tubo #1 fue el ms claro de todos y es el
tubo que contiene tan slo 0.2ml de la solucin
patrn de protena. En el tubo #2, 3, 4, y 5 el color va
aumentando en tubo en tubo, de acuerdo al aumento
de la concentracin de protena. Adems, la solucin
problema (tubo 8) tiene tambin un color claro y
present un valor de absorbancia de 0,249 que se
encuentra entre los valores del tubo #4 y 5.

Rta: El color violeta caracterstico se presenta a esa

longitud la cual se da por la coordinacin de un
tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El
complejo se basa en la desprotonacin de los grupos
amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el
establecimiento de un enlace coordinado entre el
metal y los pares de electrones libres de los tomos
de oxgeno y de nitrgeno del pptido.

.5. Explique si una curva patrn puede ser empleada

para cuantificar sustancias diferentes a las protenas y
cules seran las diferencias con estas.
6. cul es la finalidad de utilizar un tubo como
blanco? Mencione si siempre se utiliza agua como
blanco.

Despejando de la ecuacin de la recta se obtuvo una

concentracin de 130,14mg/ml de albumina
contenida en el tubo 8, y en
porcentaje
peso/volumen se obtuvo 13%. Segn Gmez, 2013.
la clara de huevo tiene 10,9 % de proteina. El
resultado obtenido es casi silimar al establecido por
Gomez.

Rta: Tomar la medida de la cual parte la curva patrn,

no siempre se utiliza agua como blanco, sino una
mezcla concentrada de la sustancia con la cual se est
trabajando.

Conclusin
Bibliografa

Aplicando el mtodo Biuret se puede determinar la

concentracin de protena en unas muestras
problema, que resulta de despejar una ecuacin de los
valores de absorbancia en una curva patrn originada
a partir de concentracin de protena conocida.

Arellano, H. G., & Duhalt, R. V. (s.f). cuantificacion

de proteinas. Recuperado el 19 de 04 de
2015,
de
http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1
998_2/bitacora.pdf.

Cuestionario:

Bolaos, N., G. L., & Herrera, C. H. (2003). Qumica

de Alimentos: Manual de laboratorio.
Recuperado el 19 de 04 de 2015, de
https://books.google.com.co/books?
id=8VpJ8foyDiIC&pg=PA36&lpg=PA36&d
q=curva+de+calibraci
%C3%B3n+para+la+determinaci
%C3%B3n+cuantitativa+de+las+prote
%C3%ADnas&source=bl&ots=q1sOlQfj1f
&sig=lqVb8LgOiSKr0VnCK2NTZ3uQqOw
&hl=es&sa=X&ei=5UcwVYrgMoKFsAWQ
-4CACw&ved.

1. Describa que es el espectrofotmetro y para qu

sirve.
Rta: Un espectrofotmetro es un instrumento para
medir la transmitancia o absorbancia de una muestra,
en funcin de la longitud de onda de la radiacin
electromagntica.Sirve
para
calcular
las
concentraciones de las distintas sustancias en funcin
de la absorcin del color.
2. defina con sus propias palabras que es una curva
patrn.

CALLE, H. D., SNCHEZ, S. C., & LAITN, J. C.

(s.f).
MANUAL
PRCTICAS
DE
LABORATORIO
DE
BIOQUMICA.
Recuperado el 19 de 04 de 2015, de
http://tux.uis.edu.co/quimica/sites/default/fil
es/paginas/archivos/V00Man10Bioqca_MF
OQ-BQ.01_08072013.pdf.

Rta: Son las medidas conocidas en orden ascendente

que sirven de gua para ajustar una solucin
problema.
3. cules son las ventajas y desventajas, de emplear
los reactivos de biuret para cuantificar protenas
explique.

Gmez, D. (2013). HUEVOS: GENERALIDADES.

Recuperado el 29 de 04 de 2015, de
https://deymerg.files.wordpress.com/2013/1
0/huevos_generalidades.pdf.

Rta: Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es

que es bastante especfico para protenas, muestra
pocas interferencias y es barato. Y la desventaja es
que es poco sensible.