Parcial: MICROBIOLOGIA ENOLOGICA.

FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA: HISTORIA

ZONAS FRIAS:

VINOS:

Embotellados
Enturbiamiento
Abundante población microbiana
Ligero CO2

BERTHELOT y De FLEURIEU (1884): disminución de acidez del vino respecto al mosto

ORDONEAU (1891): observa la desaparición del ác málico.

KUNS (1901): pone en evidencia la disminución del ác málico y aumento del láctico.

SEIFERT (1901): pone en evidencia que dicho fenómeno es de origen microbiológico - aisla
los microorganismos.

MORFOLOGÍA, TAXONOMIA, ECOLOGIA Y AISLAMIENTO:

GRUPO HETEROGENEO:

Gram (+)
Catalasa (-)
No esporulados.
Microaerofílicos (anaerobios facultativos).
Fermentadores de azúcares.
Morfología: cocos y bacilos.
 HOMOFERMENTATIVOS: basados en el catabolismo de los azúcares, 80/90% vía glicolítica
(Embden – Meyerhof).

HETEROFERMENTATIVOS: metabolizan los azícares por vía de Warbug – Dickens. ác láctico,

CO2, ác acético, acetaldehido, etanol, acetoina, diacetilo, etc.

Género:
Leuconostoc: cocos lácticos, heterofermentativos.

Estudios de Ribereau Gayon (1975): sobre 670 cepas de bacterias aisladas de uvas de distintos
países mediterráneos, determinan como especies más frecuentes en uvas, mostos,
fermentación maloláctica Leuconostoc gracile, Leuconostoc oenos, Leuconostoc hilgardii.

 En Italia Leuconostoc oenos es la que aparece con mayor porcentaje en los aislamientos
realizados.

Las bacterias lácticas se encuentran en un nicho ecológico natural- con microbiota: hongos y
bacterias, se usa técnicas para separarlos y garantizar el cultivo puro.

Levaduras eliminan por centrifugación, volviendo a centrifugar el sobrenadante y recogiendo el

precipitado bacteriano, luego diluciones en suero Ringer estéril puede sembrarse en los distintos
medios: Elliker

Rogosa / MRS
Nakagama
TJSA (tomate juice agar)
LA ( Irmman)
SA ( sucrose agar).

A estos medios se le puede adicionar antibióticos y sembrar en jarras de anaerobiosis.

Lanaridis (1983) recomienda para bacterias lácticas medios naturales a base de mosto y uva
diluido al doble enriquecido con autolizado de levadura (5 g/l )a pH 4,5.
BIOQUÍMICA DE LA FERMENTACIÓN:

A simple vista se presenta como una descarboxilación pero existen tres vías diferentes.

FACTORES QUE INFLUYEN EN EL PROCESO:

Factores ampelográficos: no todas las variedades tienen la misma relación tartárico/málico,

Barbera de Asti, dificulta la fermentación. Tempranillo es muy propenso.

Factores tecnológicos:

-eliminación de partes sólidas

-en tintos duración encubado

-escurrido precoz

-trasiegos, retardan el proceso (autólisis)

-filtración temprana, retardan

Factores físicos y químicos:

temperatura: extremos: 10ºC y 32ºC, apropiado 20ºC y 28ºC

pH: optimo 4,2 y 4,5 (el descenso hace retardar el proceso)

Existe un umbral de ataque al ác málico y un umbral de ataque a los azúcares. Mientras mayor la
diferencia, menor es el riesgo.
 Para bacilos pH optimo: 3.5 y 4.0 c/ inhibición a pH 3.0
Para cocos pH optimo: 3.0 y 4.0 siendo frenado a pH 4.5

Es importante el pH del medio que se aisló la bacteria.

Cuanto más bajo el pH la transformación es más completa, pero su inicio más lento.

Oxígeno la anaerobiosis total no es beneficiosa

Alcohol por encima de 13,5 % v/v no se produce, tanto cocos como bacilos.
El SO2 es muy perjudicial, además se sinergiza con el pH y el alcohol.

<30 mg/L SO2 Total<0,5 mg/L SO2 Molecular

Requerimientos nutritivos: indispensables el ác pantoténico y el nicotínico para el desarrollo

bacteriano.

En los vinos con FM el contenido de histaminas se ve elevado

Especies del género Pediococcus han sido descritas como formadores de histaminas.

Sustancias minerales: necesitan Mn, Mg y K.

 Métodos alternativos de reducción de la acidez málica:
Enzima maloláctica (EM) inmovilizada
Bacterias lácticas inmovilizadas
Conversión de malato en etanol(Levaduras)

Schizosaccharomyces pombe

Saccharomyces cerevisiae modif. Genétic.

No aplicables industrialmente.

Desacidif. Química (CO3Ca)

Residuos de pesticida. Son perjudiciales para el desarrollo normal . Fungicidas.
APLICACIÓN PRÁCTICA DE LA FM.

Marcha microbiológica: PARTE PRACTICA

1)Toma de muestra
2) Observación macroscópica
3) Observación microscópica
4) Siembra
5) Interpretación e Identificación
6) Informe

TOMA DE MUESTRA:

a- Aséptica

B- Representativa
 OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA:

a- Vista

b- Olfato Organoléptico

c- Gusto

A- Examen en fresco:

a) Con coloración

b) Sin coloración

Técnicas de observación
Utilidad
Examen coloreado:

Con colorantes comunes

Con colorantes especiales (Ej: fluorescentes)

Clasificación de las tinciones:

A-Tinción directa simple

B-Tinción indirecta

C-Tinción diferencial

D-Tinción vital

E- Tinción positiva

F Tinción negativa

G-Tinción metacromática.

Con colorantes comunes:

Azul de metileno
Gram Nicolle
Fundamento
Utilidad
Técnica
III) Coloración de flagelos:

IV) Coloración de esporas:

V) Con colorantes fluorescentes:

Rhodamina – auramina.

Naranja de acridina.
Medios semisólidos:
 Medio solido:

Tubos:

 A un mismo nivel
 Pico de flauta

Placas

 Plaqueos:

 Utilidad/Técnica de siembra:
1. En placa:

a. Para recuento: (ufc/mL)

- Siembra masiva

- Método del agar volcado o en profundidad

- Filtración por membrana

b. Para aislamiento:

- Agotamiento por estriación

 Siembra masiva:

 Agar volcado:

 Filtración por membrana:

INCUBACIÓN:

Temperatura:
 La mayoría: 35 -37 °C
 Unos pocos: 29 o 44,5 °C

Atmósfera:
 Aerobiosis
 Microaerofilia (Frecuente: 5-7% CO2)

Ejemplo: Campylobacter 2-3% O2

 Anaerobiosis

Estudio de cultivos:
Características de las colonias:
 Tamaño
 Forma
 Elevación de la superficie
 Margen o borde
 Superficie
 Densidad
 Consistencia
 Color

Microcopia de las colonias:

Coloración de Gram-Nicolle:

Agrupaciones:

Pruebas de identificación:

 Prueba de la catalasa
 Diferencia acéticas (+) de lácticas (-)
 Fundamento:
H2O2 H2O + ½ O2 (gas)
 Producción de pigmentos

Producción de pigmentos por especies de Pseudomonas aeruginosa.

Técnica:

Prueba de la oxidasa:

 Fundamento: detección de la producción de alguna

Citocromo C oxidasa

 Técnica:

Prueba del Voges Proskauer:

 Fundamento: transformación del ácido pirúvico en acetoína, la cual en presencia de KOH

40% se convierte en diacetilo con α naftol como catalizador.

 Técnica:
Prueba de la β galactosidasa:

 Fundamento: detección de la presencia de β galactosidasa (fermentación tardía de

la lactosa)

Técnica:

Prueba de motilidad:

 Fundamento: poner de manifiesto la capacidad de moverse y lo hacen por medio

de flagelos
 Técnica:
 Desarrollo en medio de TSI:

 Fundamento: se determina la fermentación de 3 azúcares, glucosa, lactosa

y sacarosa; producción de gas (H2 y CO2) y formación de SH2.

 Técnica:

La vinificación… ¿una isla de MacArthur?

Teoría de biogeografía de islas (1967).

TAMAÑO DISTANCIA

EXTINCION MIGRACION

Equilibrio dinámico:
 Colonización:

 Tasa de natalidad.
 Tasa de mortandad.
 Capacidad de carga de ambiente. (factores limitantes)

Crecimiento logístico y exponencial:

R estragedias, y k estragedas:

Ecologia/poblaciones:

Levaduras.

Insectos. bacterias.

PRUINAS

Mohos. Protozos.
La epidermis y los estomas:
 Fermentativas y oxidativas:

 Saccharomyces cerevisiae.
 Schizozaccharomyces pombe.
 Saccharomycodes ludwigii.
 Kloeckera apiculata.

Bacterias lácticas:
Bacterias acéticas:

Medio:

Fermentación malolactica:
Desarrollo típico de una fermentación:

rA
e
a
n S
m
h
is.c
b
o G
y
d
tu
l
Tolerancia a etanol, y membrana celular.