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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS


ESCUELA DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRÁCTICA N° 1: “BIOQUÍMICA MICROBIANA”

CURSO:
BIOTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

DOCENTE:
ING. JULIO RODRIGUEZ DÍAZ

PRESENTADO POR:
1. ALVAREZ MOLINA, EVA LUZ
2. PICHA MAMANI, MARCELA

HORA: (Lunes 10:50-


12:20 pm)

AREQUIPA –PERU
2018
PRÁCTICA N° 1: “BIOQUÍMICA MICROBIANA”
PRÁCTICA N° 1

BIOQUÍMICA MICROBIANA

I. INTRODUCCIÓN
Las levaduras son hongos unicelulares que se han utilizado durante siglos para la
obtención de productos como el vino, la cerveza o el pan. Todas metabolizan
azúcares como la glucosa, fructosa y manosa, pero algunas son capaces de hacerlo
en condiciones anaerobias, con la producción de alcohol y anhídrido carbónico, en
el proceso conocido como fermentación. La reproducción de las levaduras, en
especial las utilizadas industrialmente, es normalmente asexual, a través de la
gemación en la superficie, pero la reproducción sexual también se puede dar en
determinadas condiciones (Mortimer et al., 1994; Codón et al., 1995).

La fermentación alcohólica es la transformación de los azúcares del mosto (glucosa


y fructosa) en etanol y CO2. Este proceso es exclusivamente llevado a cabo por las
levaduras. En los primeros días de fermentación, los géneros mayoritarios son
Hanseniaspora/Kloeckera, Candida y en menor medida Hansenula, Pichia,
Rhodotorula, Metschnikowia (Fleet y Heard, 1993; Fleet et al., 1998). En los
siguientes días de fermentación, las poblaciones de estas especies de menor poder
fermentativo disminuyen progresivamente, siendo reemplazadas por la especie de
mayor tolerancia al etanol, S. cerevisiae, considerada la principal especie del
proceso (Torija et al., 2001; Beltran et al., 2002).
Tradicionalmente este proceso fermentativo se ha realizado de manera espontánea,
es decir, mediante el desarrollo de las levaduras asociadas a las uvas. Sin embargo,
la selección de cepas de Saccharomyces y su posterior comercialización como
levaduras secas activas (LSA), ha permitido a los enólogos la utilización cada
vendimia de las mismas cepas de levadura. Esto supuso un avance biotecnológico,
que ha permitido un mayor control del proceso y una mejor estandarización en la
calidad de los vinos año tras año.

En la actualidad existe una demanda cada vez mayor de nuevas cepas de levaduras
que no solo sean capaces de catalizar de manera eficiente y completa el paso de
azúcares a etanol, sino que además deben de poseer otras propiedades como vigor
fermentativo, velocidad de fermentación, modo de crecimiento en cultivo líquido,
baja producción de espuma, temperatura óptima de fermentación, producción de
glicerol, alta resistencia al cobre y capacidad de reducir su contenido, entre otros.

En el presente trabajo se realiza un estudio de la bioquímica microbiana a través del


proceso reproductivo de la levadura Saccharomyces Cerevisiae, con la finalidad de
conocer los parámetros más importantes en la fermentación alcohólica.

PRÁCTICA N° 1: “BIOQUÍMICA MICROBIANA”


II. OBJETIVOS
 Estudiar la bioquímica microbiana a través del proceso reproductivo de la
levadura Saccharomyces Cerevisiae: biomasa.

 Estudiar la bioquímica microbiana a través del proceso reproductivo de la


levadura Saccharomyces Cerevisiae: alcohol.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO


3.1.SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Saccharomyces cerevisiae, es una levadura que constituye el grupo de


microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad;
su nombre deriva del vocablo Saccharo (azúcar), myces (hongo) y cerevisiae (cerveza),
(Hernández, 1999).

Figura 1. Levadura.

Es una levadura heterótrofa, que obtiene la energía a partir de la glucosa y tiene una
elevada capacidad fermentativa (Querol, 2003). El uso más extendido está enmarcado
en la panificación y en las industrias de fabricación de cerveza, vinos y alcohol. La
levadura inactivada por temperatura se usa como fuente de nutrimentos en alimentación
animal y humana, tanto en forma de levadura íntegra como a partir de sus derivados
(García, 2000).

Fuente: García, 2000. NR (no referido), * (expresado en ARN).

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3.2. PROCESO DE PRODUCCIÓN DE ALCOHOL
El proceso de producción de alcohol por vía fermentativa es a través de la
conversión de hexosas en etanol según la siguiente ecuación:

Hexosas + Levadura → Etanol + CO2 + Levadura

3.3.FACTORES EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LA


LEVADURA
 Presión osmótica: la nutrición de la levadura es un proceso puramente osmótico,
es importante evitar medios hipertónicos o hipotónicos para evitar la
plasmoptisis y plasmólisis. El estrés osmótico puede causar una disminución en
el volumen celular, afecta además, la velocidad de fermentación, así como la
viabilidad celular (Seo, 2005).
 Temperatura: las altas temperaturas ocasionan una disminución de la biomasa,
producto de un descenso en el contenido de proteínas, RNA; DNA y
aminoácidos libres e induce a la rigidez de la membrana celular. Temperaturas
muy bajas provocan un estado de latencia en la célula, deteniendo su desarrollo
(Tomasso, 2004).
 Desecación: es uno de los principales agentes que inhiben las actividades y
desarrollo de los microorganismos.
 Luz: en general la luz es perjudicial para los microorganismos que carecen de
clorofila, o cualquier otro pigmento que les permita usar la energía de las
radiaciones en el proceso de fotosíntesis.
 pH: el pH óptimo en el cual se desarrollan mejor los microorganismos, está
entre 4 y 5. Las levaduras tienen la ventaja de soportar, medios más ácidos, que
otros microorganismos, lo que es aprovechado en los procesos industriales para
mantener el medio controlado de bacterias que puedan competir por el sustrato.
 Alcohol: el efecto del etanol en la célula es una combinación de inhibición del
crecimiento y disminución de la viabilidad, puede actuar como inhibidor de la
fermentación a partir de un 8 %. Riegel afirma, que no es recomendable
terminar la fermentación con un grado alcohólico muy elevado.

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IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Material, Instrumental y Equipos:
Materiales:
 Algarrobina
 Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
 Peptona
 Azucares: glucosa, fructosa, maltosa, galactosa.
 Agua destilada
 Arena tratada
 Fosfato de amonio
Equipos e instrumental:
 Matraz de 500 ml
 Fermentadores
 Vasos de 250 ml
 Tubos de ensayo de 20 ml
 Pipetas de 1 y 10 ml
 Placas Petri
 Probeta de 100 ml
 Alcoholímetro
 Termómetro
 Centrífuga
 Equipo de destilación
 Balanza
 Cocina
 Mechero
 Refractómetro

4.2 Procedimiento:
4.2.1 Caracterización del sustrato: Medición de grados Brix: Se procederá a
hacer la medición de los grados Brix con ayuda del refractómetro.
4.2.2 Caracterización de la levadura: Determinación de la capacidad
fermentativa de la levadura: Se realizará una determinación visual,
colocándose 20mL de caldos nutritivos (suspensiones de los azúcares a
probar: 1%azúcar, 1%g de peptona en agua destilada), se inoculará la
levadura bajo condiciones asépticas. Los tubos serán incubados a 30°C por
2 a 4 días, pasado este tiempo se notará que ciertos tubos presentan
formación de gas, ello indicaría que dichos azúcares son fermentados por la
levadura en estudio.
4.2.3 Producción de biomasa y alcohol
4.2.3.1 Preparación de la algarrobina:
Tomar un matraz y llenar entre el 70-75% con algarrobina previamente
estandarizada a valores de 16 a 20°Brix con agua (solo en caso de ser

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necesario, se le enriquecerá con fosfato de amonio a un nivel de 1%, luego
se le corregirá el pH a un valor de 4,5 con una solución de ácido cítrico,
finalmente todo ello se esterilizará a 120°C por 15min, una vez frio se
inoculará la levadura activada (Pre cultivo) en un 5% del volumen inicial.
Una vez preparado todo se procederá a poner el sistema a incubarlo por 4
días en una estufa a 30°C, con agitación diaria. Pasado el tiempo
establecido se procederá a guardarlo en refrigeración hasta el momento de
efectuar su análisis.
4.2.3.2 Obtención de la biomasa y alcohol:
Las muestras refrigeradas serán refrigeradas a 4000 r.p.m, por espacio de
15 minutos. Se decantará el sobrenadante (no desecharlo) y el precipitado
será lavado con agua y se volverá a centrifugar. En una placa petri se
colocará 3mL de la suspensión 3gr de arena lavada, todo el conjunto se
pesará y se llevará a la estufa a 105°C por espacio de 6 a 10 horas hasta
peso constante.

El sobrenadante separado se evaluará: La presencia de alcohol, cantidad de


alcohol formado, grados alcohólicos producidos (alcoholímetro).

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
5.1.CARACTERIZACION DE LA LEVADURA.

Después de observar durante cuatro días y cada dos horas, el resultado es el


siguiente:
Resultado visual de la producción de CO2 de las muestras

Figura 2. Muestra de azucares con su respectiva producción de CO2.

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Cuadro 1. Muestras de azúcar y la producción de CO2.
Muestras de azúcar y la producción de CO2

Muestra 1: MALTOSA y la Muestra 2: GLUCOSA y la


producción de CO2. producción de CO2.

Muestra 3: GALACTOSA y la Muestra 4: FRUCTOSA y la


producción de CO2. producción de CO2.
Fuente: Elaboración propia, 2018.

En el Cuadro 1 se observa imágenes (tubos de ensayo) con la producción de


CO2 en muestras de azúcar (maltosa, glucosa, galactosa y fructosa).

Según lo observado la mayor producción de CO2 es la glucosa (muestra 2);


seguida de la galactosa (muestra 3), la fructosa (muestra 4); y con menor
producción de CO2 es la maltosa (muestra 1).

La producción de CO2 es apreciado con mayor facilidad en la GLUCOSA


(muestra 2), ello indica que la fermentación con levadura Saccharomyces
cerevisiae es más rápida.

La fructosa, galactosa y maltosa en comparación con la glucosa presentan


formación de gas (CO2) en menor cantidad, ello indica que los estos azucares
son lentos en fermentar con la levadura Saccharomyces cerevisiae.

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 Según Morrison, 1998; indica que los azúcares más simples son los
monosacáridos, que son los únicos azúcares que pueden fermentarse
directamente. Además, son los bloques constituyentes de los azúcares
más complejos.

Asimismo recalca que los únicos azúcares que pueden fermentarse por
las enzimas producidas por las levaduras son la manosa, galactosa,
glucosa y fructosa. Así, la glucosa y la fructosa son fermentadas por la
enzima zimasa.

La maltosa como disacárido tiene menos probabilidades de producir CO2 como


se observó en la práctica.

 Según Morrison, 1998; La fermentación de un disacárido es más


complicada porque antes de la fermentación se requiere una hidrólisis
propiciada por la hidrolasa. La hidrólisis de la sacarosa se efectúa
mediante una hidrolasa llamada invertasa, a partir de la cual ocurre la
fermentación de la glucosa y fructosa.

Para identificar si el azúcar ha sido fermentado con la levadura se observó la


formación de una pequeña capsula haciendo referencia la formación de CO2.

 De acuerdo a Barrera, 2011; El desprendimiento de CO2 ayuda a


evidenciar la cantidad de sustrato fermentado por la levadura, lo que
ofrece información valiosa sobre el alimento que favorece el crecimiento
de este organismo.

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5.2.PRODUCCION DE BIOMASA Y ALCOHOL

Obtención de BIOMASA.

Después de centrifugar la muestra de algarrobina se obtiene un precipitado del


cual es necesario determinar el % de humedad.

Cuadro 2. Obtención de BIOMASA.


CARACTERISTICAS PESO

Peso de la placa 43.58g


Peso inicial (Pi): Peso de placa (43.58) +
biomasa (3 g) + arena (3g)
49.58g

Peso final (Pf): total después del


desecado
48.28g

Peso en base seca de biomasa 1.3g


Fuente: Elaboración propia, 2018.

En el Cuadro 2 se observa datos para la obtención el % de humedad para


luego determinar la materia seca y finalmente poder hallar la cantidad de
biomasa.
Para determinar la BIOMASA se realiza los siguientes cálculos:

 %HUMEDAD
𝑷𝒊 − 𝑷𝒇
%𝑯𝑼𝑴𝑬𝑫𝑨𝑫 = ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝑷𝒎
𝟒𝟗. 𝟓𝟖𝒈 − 𝟒𝟖. 𝟐𝟖𝒈
%𝑯𝑼𝑴𝑬𝑫𝑨𝑫 = ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝟑𝒈
%𝑯𝑼𝑴𝑬𝑫𝑨𝑫 = 𝟒𝟑. 𝟑%
 %MATERIA SECA (MS)

%𝑴𝑺 = 𝟏𝟎𝟎% − %𝑯𝑼𝑴𝑬𝑫𝑨𝑫


%𝑴𝑺 = 𝟏𝟎𝟎% − 𝟒𝟑. 𝟑%
%𝑴𝑺 = 𝟓𝟕%
%𝑴𝑺 = 𝟓𝟔. 𝟕𝒈/𝟏𝟎𝟎𝒈

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 Para hallar la CANTIDAD DE BIOMASA
56.7g………….100
X……………12.88g (precipitado)
X=7.30 (MASA SECA BIOMASA)

 Para hallar la BIOMASA expresado en materia seca por litro


𝟕. 𝟑𝟎𝒈𝑴𝑺
𝑿=
𝟏𝟖𝟕. 𝟓𝒎𝑳
𝟎. 𝟎𝟑𝟖𝟗 𝒈 𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳
𝑿= ∗
𝒎𝑳 𝟏𝑳

𝑿 = 𝟑𝟖. 𝟗𝟑𝒈/𝑳 (BIOMASA)

El precipitado se colocó en placas Petri de peso conocido y se llevó a la estufa a


una temperatura de 105 °C, las cuales fueron pesadas con la finalidad de obtener
peso seco de la biomasa.

 Según Tomasso, 2004; Las altas temperaturas ocasionan una disminución


de la biomasa, producto de un descenso en el contenido de proteínas,
RNA; DNA y aminoácidos libres e induce a la rigidez de la membrana
celular. Temperaturas muy bajas provocan un estado de latencia en la
célula, deteniendo su desarrollo.
 De acuerdo a Shuler y Kargi 1992; En el caso de Saccharomyces
cerevisiae, el obtener una productividad de biomasa baja, puede
relacionarse con la concentración inicial de azucares en el medio de
crecimiento.

La biomasa obtenida es de 38.93 g/L, esta cantidad es demasiada alta en


comparación con datos bibliográficos.

 Diferentes trabajos muestran una producción de biomasa entre 2.0 y 2.8


g/L para una concentración inicial de etanol de 16 g/L de medio; y de 3.3
g/L a partir de una concentración inicial de 32 g/L de medio (Doménech
et al, 1999).
 En un estudio comparativo entre la melaza y el etanol rectificado como
sustratos para C. utilis se encontró una producción de biomasa de 6.90
g/L y 5.94 g/L respectivamente partiendo de una concentración de 22.43
g/L (Vejarano, 2005); también se ha encontrado una mayor producción
de biomasa 10.25 g/L utilizando melaza a 15 g/L de ART como sustrato
(León, 2005).

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Obtención de ALCOHOL.
Cuadro 3. Característica de la algarrobina.
MUESTRA CARACTERISTICAS

Algarrobina Volumen total 187.5 ml

Fuente: Elaboración propia, 2018.


En el Cuadro 3 se observa las característica final de la algarrobina, tiene
un volumen total final de 87.5 mL.
Cuadro 4. Entradas y salidas según los procesos realizados (centrifugación y
destilación).
INGRESO PROCESO SE OBTIENE
187.5ml CENTRIFUGACIÓN 150ml (sobrenadante)

150ml DESTILACION 120ml de destilado


sobrenadante (alcohol) y un grado
alcohólico e 11.5 cc.
Fuente: Elaboración propia, 2018.
En el Cuadro 4 se detalla los procesos para la determinación del grado
alcohólico y el rendimiento. En dichos procesos se obtienen los siguientes datos

 Después de la centrifugación se obtiene 150 mL de sobrenadante.


 Después de la destilación se obtiene 120 mL de alcohol.

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Cuadro 5. Obtención de ALCOHOL.
CARCTERISTICAS PESO

Obtención de alcohol 120ml

Grado alcohólico de la muestra 11.5 cc


Fuente: Elaboración propia, 2018.

En el Cuadro 5 se observa la cantidad obtenida de alcohol en la


muestra a base de algarrobo y los grados alcohólicos 11.5 cc .

El grado alcohólico obtenido es un valor promedio, ello indica que la


fermentación fue adecuada.
 Segun Riegel, 2003; El efecto del etanol en la célula es una combinación
de inhibición del crecimiento y disminución de la viabilidad, puede
actuar como inhibidor de la fermentación a partir de un 8 %. Riegel
afirma, que no es recomendable terminar la fermentación con un grado
alcohólico muy elevado.

OBTENCION DEL RENDIMIENTO DE ALCOHOL EN g/L

 150mL (sobrenadante)
 120 mL de destilado
 200ml(enrasado: 120 mL + 80 mL de agua destilada)

 Calcular:
𝑽𝟏𝑪𝟏 = 𝑽𝟐𝑪𝟐
(𝟐𝟎𝟎𝒎𝒍)(𝟏𝟏. 𝟓𝒄𝒄) = (𝟏𝟐𝟎𝒎𝒍)(𝑪𝟐)
𝑪𝟐 = 𝟏𝟗. 𝟏𝟔𝒈/𝟏𝟎𝟎𝒎𝒍
𝒈
𝑪𝟐 = 𝟏𝟗𝟏. 𝟔
𝑳

La fermentación en la algarrobina se dio gracias a la levadura Saccharomyces


cerevisiae, dando así la reacción de glucosa a etanol.
 De acuerdo van Dijken y Scheffers, 1986; La levadura Saccharomyces
cerevisiae puede fermentar la glucosa a etanol. En condiciones
anaerobias ésta es la única manera de producir energía. En la presencia
de oxígeno, tiene lugar la respiración. Sin embargo, se puede producir
fermentación alcohólica incluso en condiciones aerobias si la
concentración de glucosa sobrepasa un valor límite crítico. Esto es lo que
se conoce como efecto Crabtree.

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El rendimiento total de alcohol fue de 191.6g/L de la biomasa total.
 Según Otero, 2005 indica que la obtención del alcohol como factor
principal de la obtención de biomasa, representa al rendimiento total de
la biomasa producida.

VI. CONCLUSIONES

 Se llegó a observar el proceso metabólico de los tipos de azúcar (glucosa,


galactosa, fructosa y maltosa), según la producción de CO2.
 Se llegó a obtener la producción de biomasa y alcohol a partir del sustrato
preparado, mediante un proceso de fermentación de la levadura Saccharomyces
Cerevisiae.
 Se llegó a conocer cuán importante es la levadura saccharomyces Cerevisiae en
la obtención de alcohol y fermentos.

VII.RECOMENDACIONES
 Durante el proceso de inoculación de la levadura, se debe cuidar que el
ambiente esté esterilizado, se debe trabajar con la indumentaria adecuada
para no alterar los resultados del proceso.
 Es importante controlar la temperatura al momento de la inoculación de la
levadura, ya que si la T° es > a 30°C, las levaduras morirían; si la T° < a
30°C las levaduras se inactivarían.

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VIII. BIBLIOGRAFIA
 Barrera, I.; González, R.A.; Salgado, E.; Aranda, J.S. 2011). A simple
metabolic flux balance analysis of bio-mass and bioetanol production in
Saccharomyces cerevisiaefed-batch cultures, Biotechnol.Bioprocess Eng. 16
(1):13-22.
 Beltran, G. , Torija, M.J Novo, M., Ferrer, N. Poblet, M., Guillamon, J.M.
(2002). Analysis of yeast populations during alcoholic fermentation: a six
year follow-up study, Systematic and Applied Microbiology, 25: 287-293.
 Figueroa, V. (1996). Producción porcina con cultivos tropicales y reciclajes
de nutrientes. Ed. Academia. LaHabana. Cuba. 192 pp.
 García, J.; Sáenz, T. (2000).Levadura Saccharomyces. Manual de los
Derivados de la Caña de Azúcar.Tercera Edición. Capítulo 4.12, pág.239-
242.
 Hernández, D.R. (1999). Efecto de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae
en consumo, digestibilidad y variables ruminales en borregos alimentados
con pasto ovillo (Dactylis glomerata) cosechado a dos intervalos de rebrote.
Tesis de maestria en ciencias. Colegio de Posgraduados, Montecillo Méx.74
p.
 Jacques, K.A. et. al. (2003) The Alcohol Textbook.4ta. Edición, Nottingham
University Press, Inglaterra, 446 pp.
 León, C. 2005. Influencia de la concentración de melaza de Saccharum
officinarum L. “caña de azúcar” en la producción de proteína unicelular de
Candida utilis var. major. Tesis para optar el grado de Maestro en Ciencias.
Mención Biotecnología y Bioingeniería. Universidad Nacional de Trujillo.
Trujillo. Perú.
 Morrison J. y Boyd. (1998) Química Orgánica. 5ta. Edición, Pearson,
México, 1474 pp.
 Querol, A. (2003). Molecular evolution in yeast of biotechnological interest.
Int. Microbiol. 6: 201-05.
 Riegel, E.R.; Kent, J.A. (2003)Riegel's Handbook of Industrial Chemistry
Ed. Springer Verlag. ISBN 0-306-47411-5.
 Seo, J.-S. et al. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 63-68.
 SHULER, M.; KARGI, F. 1992. Bioprocess engineering:Basics concepts.
New Jersey, USA. Editorial PrenticeHall. p. 25
 Tomasso, Mauricio. (2004). Tolerancia de las levaduras al etanol.
Universidad de la República Uruguay. Facultad de Química.
 Vejarano, R. 2005. Estudio comparativo de la producción de biomasa con
acetato de etilo por Candida utilis CECT 10704 a partir de melaza de caña
de azúcar (Saccharum officinarum), etanol rectificado y etanol sin rectificar
como fuentes de carbono. Tesis para optar el título profesional de Ingeniero
Agroindustrial. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional
de Trujillo. Trujillo. Perú.

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IX. ANEXOS

9.1 Fotografías de algunos materiales utilizados

Tabla 2. Materiales a utilizar.


Materiales a utilizar

Sustrato: algarrobina Levadura

Fosfato de amonio a 1 %
Azucares: glucosa, fructosa,
galactosa.

Arena tratada
Agua destilada

Fuente: Elaboración propia, 2018.

9.2 Fotografías del procedimiento para la caracterización de la levadura.

Tabla 2. Caracterización de la levadura

Pasos realizados para la Caracterización de la levadura

Colocar 10 ml de caldos
nutritivos (suspensión de 1
% de azúcar (0.1 g) y 1 %
de levadura).

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Después los tubos con los
caldos se cierran bien y se
llevan a esterilización.

Los tubos serán incubados


a 30°C por 2 a 4 días.

Después de 4 días de
incubación, se observa
que el tubo con glucosa
presenta formación de gas
(CO2).

Fuente: Elaboración propia, 2018.

9.3 Fotografías de la descripción de pasos para determinar la producción de


biomasa y alcohol.

Tabla 3. Pasos para determinar la producción de biomasa y alcohol


Preparación de algarrobina
1. Determinar el ° Brix inicial de la
muestra (algarrobina).

2.En un matraz llenar entre el 70-


75% con algarrobina previamente
estandarizada a valores de 16 y
20°Brix con agua (solo en el caso de
ser necesario),se le enriquecerá con
fosfato de amonio a un nivel de 1%,
luego se le corregirá el pH a un valor
de 4.5 con una solución de caído
cítrico.

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3. La muestra ya corregida y
preparada se esterilizara a 120°c por
15min, una vez frio se inoculara la
levadura activada (pre cultivo) en un
5% del volumen inicial.

4. Una vez preparado todo se


procederá a poner el sistema a
incubarlo por 4 días en una estufa a
30°c, con agitación diaria.
Pasado el tiempo establecido se
procederá a guardarlo en
refrigeración hasta el momento de
efectuar sus análisis.

Fuente: Elaboración propia, 2018.

Tabla 4. Obtención de la biomasa y alcohol

1. Después que la muestra fue refrigerada, 2. La muestra es centrifugada a 4000


procedemos a llenar en viales con pesos rpm, por un tiempo de 15 minutos.
homogéneos.

Sobrenadante

3. Extraído la muestra centrifugada se 4. El precipitado obtenido será lavado


decantara el sobrenadante. con agua y se volverá a centrifugar.

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5. En una placa Petri se colocara 3g.de la 6. El conjunto de placas se llevara a
suspensión más 3g de arena lavada (3 la estufa a 105°c por espacio de 6 a
placas de repetición). 10hrs hasta obtener un peso
constante.

Finalmente el sobrenadante separado se


evaluara: La presencia de alcohol,
cantidad de alcohol formado, grados
alcohólicos producidos (alcoholímetro.)

Fuente: Elaboración propia, 2018.


9.4 Cálculos realizados durante la experiencia.

Tabla 5. Cálculos para preparar la muestra de algarrobina.


Cálculos para preparar la muestra
1. Para hallar el volumen 2. Para determinar la cantidad de algarrobina
total de la muestra a en 16 – 20°brix.
preparar. En un matraz
de 250 mL.
𝑽𝟏𝑪𝟏 = 𝑽𝟐𝑪𝟐
250mL…………100% 𝑽𝟏(𝟕𝟕°𝑩𝒓𝒊𝒙) = 𝟏𝟖𝟕. 𝟓𝒎𝒍(𝟏𝟔°𝑩𝒓𝒊𝒙)
X…………75% 𝑽𝟏 = 𝟑𝟗𝒎𝑳. De algarrobina
X=187.5Ml.  AGUA:148.5 ml.
𝑽𝟏𝑪𝟏 = 𝑽𝟐𝑪𝟐
𝑽𝟏(𝟕𝟕°𝑩𝒓𝒊𝒙) = 𝟏𝟖𝟕. 𝟓𝒎𝒍(𝟐𝟎°𝑩𝒓𝒊𝒙)
𝑽𝟏 = 𝟒𝟗 de algarrobina
 AGUA: 138.5ml.

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3. Añadimos fosfato de 4. Muestra para inocular la levadura
amonio al 1%.
 La adición del fosfato 187.5……..100%
de amonio no es
importante. X………….5%
X=9.375 mL.preparada
187.5……………100%
X………………...1%
X=1.875 ml
5. Cantidad de levadura a 187.5………100%
incorporar.
X……………3.5
X=6.56g de levadura
Fuente. Elaboración propia, 2018.

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