PRÁCTICA N° 7

PRINCIPIOS DE MICROBIOLOGÍA Y FERMENTACIONES

Resumen

La práctica de Microbiología y fermentaciones se dividió en dos etapas, la primera corresponde a

Microbiología y la segunda, a fermentaciones.

Para microbiología se utilizarán agar nutritivo, un medio de cultivo sólido en el que crecen todo tipo
de bacterias [1], y agar PDA, un medio de cultivo utilizado para el crecimiento de hongos [2] en
muestras del entorno; en nuestro caso, corresponde a microorganismos presentes en una unidad
sanitaria. Para garantizar el crecimiento de los microorganismos (hongos o bacterias) se mantendrá el
sistema aislado de la entrada de aire por una semana, luego de la cual se llevarán muestras de cada
cultivo a observación microscópica, para verificar el microorganismo que creció en cada uno.

La segunda etapa de la práctica corresponde a fermentaciones, para la cual se tomará como fuente
de mosto, fresas en poca agua y se le agregará azúcar hasta que los grados de alcohol (grados Brix), es
decir, el porcentaje de sólidos en alguna sustancia; en nuestro caso, corresponde al porcentaje de
azúcar presente en el jugo de la fresa, hasta que se alcancen 24 o 25 ° Brix [3]. Luego se agrega el
inóculo, es decir, el microorganismo que se proporcionará para garantizar la fermentación [4], al
mosto, el cual comprende del 1% de levadura y 10% de agua de acuerdo al volumen del mosto. En
este caso, se deja el sistema en ausencia de oxígeno, bloqueando la entrada de oxígeno con un globo
con agujeros y dejándolo aproximadamente 15 días en un espacio oscuro.

Introducción

En esta práctica nos concentraremos en aplicar los conceptos aportados por la Bioquímica, en cuanto
a especies de menor tamaño en el entorno, tales como bacterias y hongos; proveyéndoles del medio
de cultivo propicio para cada uno, Agar Nutritivo y Agar PDA respectivamente. También aplicaremos
el principio de fermentación, a través de un hongo, levadura, proporcionándoles las condiciones
óptimas de crecimiento para producción de alcohol (etanol); es decir, ausencia de oxígeno, y 10% de
inóculo a temperatura entre 35 y 40°C.
 Marco teórico

Clasificación de organismos y microorganismos

Los organismos y microorganismos se pueden clasificar como se muestra en la figura 1.

Figura 1. Clasificación de organismos y microorganismos

Técnicas de identificación de cepas

 Identificación microscópica: por medio de tinción de Gram la cual informa la presencia o no

de bacterias. Si hay bacterias se indicará si son Gram positivas (púrpuras) o Gram negativas
(rosas), qué forma tienen, y cómo se organizan. Según su forma pueden ser cocos (esferas),
bacilos (cilindros finos) o cocobacilos. Se pueden organizar en racimo o en cadenas; a veces
están dispersas y tinción de azul de metileno.
 Identificación macroscópica:
- Morfología: tamaño, forma, consistencia y textura, superficie, comportamiento con respecto
a la luz, color, olor.
 - Hemolisis: Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen
responden de diferente manera según realicen o no la lisis de los glóbulos rojos (hemólisis)
producida por la acción de una enzima llamada hemolisina existen tres tipos: alfa: es una
hemólisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso. Beta:
en este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente
transparente.

- Gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión no es capaz de realizar la hemólisis y

por tanto no existe halo alrededor de la colonia.
 Identificación a través de medios de cultivo:
-  Medios básicos: son medios ricos en nutrientes que permiten el crecimiento de la gran
mayoría de las bacterias.
- Medios de enriquecimiento: están desarrollados para recuperar bacterias exigentes en sus
requerimientos nutricionales. Se utilizan para bacterias que no crecen en medios básicos.
- Medios selectivos: contienen sustancias como cloruro sódico a dosis elevadas, citrato sódico,
cristal violeta, sales biliares o antibióticos y antisépticos que fomentan el crecimiento de
algunas bacterias y evitan el de otras.
- Medios diferenciales: se utilizan para poner de manifiesto características distintivas de las
colonias. Son medios que distinguen entre distintos grupos bacterianos en función casi
siempre del color de sus colonias.
- Medios cromogénicos: en estos se incorporan sustancias cromogénicas para detectar
distintas enzimas producidas por los microorganismos.

 Identificación a través de pruebas bioquímicas:

Permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de
identificación. Las pruebas utilizadas son de catalasa, oxidasa, Hidrólisis del hipurato, β-
galactosidasa, Aminopeptidasa, LAP, ureasa, indol, oxido-fermentación, rojo de metilo,
Fenilalanina-desaminasa., coagulasa, lipasa.

 Identificación a través de pruebas moleculares:

Extracción de ADN, amplificación, PCR.

- Fermentación: La fermentación es un proceso de oxidación anaeróbica o parcialmente

anaeróbica de carbohidratos. La fermentación es un proceso catabólico de oxidación
incompleta, totalmente anaeróbico, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos
productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones

Tipos de fermentación:

- Alcohólica: Las levaduras son los convertidores de aldehídos a alcoholes más eficientes.
- Acética: Resulta de la oxidación del alcohol por la bacteria del vinagre en presencia del
oxígeno del aire requiere mayor oxígeno para su crecimiento y actividad
- Láctica: Son de gran importancia en la conservación de alimentos.
- Cítrica: La fermentación más común es aquella en que ocurre una oxidación parcial del
azúcar. En este caso el azúcar puede ser convertido en ácido. Finalmente el ácido puede ser
oxidado para dar bióxido de carbono y agua, si se permite que ocurra.
 - Butírica: Son menos útiles en la conservación de alimentos. Los organismos son anaeróbicas e
imparten sabores y olores indeseables a los alimentos.

Materiales y métodos

 Materiales y vidriería

Cajas de Petri Beaker Probetas Recipiente de almacenamiento

 Reactivos Medios de cultivo (comercial):

Agar Nutritivo y Agar PDA

 Tinción de Gram
 Reactivos:

Azul de metileno Cristal violeta Lugol de Gram Alcohol etílico Acetona Safranina Aceite
de inmersión

 Equipos y utensilios:
- Asa de siembra
- Mechero de alcohol
- Microscopio

Resultados y análisis

 Microbiología
- En agar nutritivo crecieron bacterias similares en forma, color y textura; sin embargo, creció
una distinta, de forma ovalada, coloración blanca, bordes definidos, compartiendo la misma
textura, mucoide (cremosa).
- En agar PDA crecieron hongos, observamos uno en particular, que presentó coloración café,
de forma circular y rodeada por filamentos cortos (en forma de vellos pequeños).
 - Para la verificación de los microorganismos que proliferaron, se usaron varias sustancias:
Cristal violeta, durante un minuto, y se presenta coloración morada; luego se agregó ugol por
un minuto, alcohol acetona por 20 segundos y safranina (de color rojo) por 1 minuto.
 Fermentación
Para garantizar la producción de etanol, se verificaron los grados Brix del mosto a partir del
refractómetro, correspondientes a 5 °, por lo cual se agregó azúcar hasta los 24° de alcohol.

Conclusiones

La bacteria seleccionada para análisis cualitativo y microscópico, presentó coloración violeta

al aplicarle cristal violeta, y la safranina no causó coloración alguna, con lo cual se puede
determinar que el comportamiento de la misma es Gram positivo.

Bibliografía
Gil, M. (s.f.). lifeder.com. Obtenido de https://www.lifeder.com/agar-nutriente/

NEOGEN CORPORATION. (04 de Diciembre de 2015). Obtenido de

https://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7149_sp_pi.pdf

Pérez, V. (12 de Julio de 2016). ONsalus. Obtenido de https://www.onsalus.com/definicion-de-

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sunzest fruits. (2016). Obtenido de https://www.sunzestfruits.com/grados-brix-sobre-el-azucar-de-

las-frutas/

Universidad Pontificia Bolivariana. (s.f.). PRÁCTICA N°7 PRINCIPIOS DE MICROBIOLOGÍA Y

FERMENTACIONES. Medellín.