PRACTICA Nº2

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO TOTAL DE MICROORGANISMOS.

RECUENTO TOTAL POR EL MÉTODO DE BREED

I. INTRODUCCION

Los recuentos microscópicos directos permiten determinar el número de células

microbianas, por observación directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja ya
que la muestra puede utilizarse tal cual, (si es líquida como leche o cultivos puros en
medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros
métodos de recuento.

Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis

coloreados, cámaras del tipo de las de contar glóbulos, o las especialmente diseñadas
para contar hongos en alimentos como la cámara de Howard.

Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES)

Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados
metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de
levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no
absorben el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el
colorante y se verán azules).

El método de Breed es un método de recuento directo bastante simple, fácil y eficaz a

pesar de ser un método antiguo (1911). Este método de Conteo Directo al Microscopio
(CMD) es usado mayoritariamente para el diagnóstico microbiológico de la leche y se
lo considera un método rápido para estimar el grado de contaminación bacteriano de
la leche pero que no está diseñado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el
conteo en placa es más preciso, más práctico y más barato que un conteo directo
ejecutado adecuadamente. Si el método se contemplara como un método para estimar
la calidad de la leche con propósito de pago, su uso sería limitado para pequeño
número de muestras con alto contenido bacteriano (2.3 x 10 6 ufc/mL) debido a la
insensibilidad del método.

El método de Breed también es usado para diagnóstico de mastitis bovina (diagnóstico

subclínico). En ésta, el coloreado con azul de metileno nos permite ver además
leucocitos y células somáticas, también se pueden usar coloraciones por los métodos
de Levowitz–Weber o Broadhurst–Paley que permiten observar específicamente
células somáticas en leche.

II. OBJETIVO

 Determinar el número de microorganismos totales, viables y no

viables en una muestra de leche por el método de breed.
III. MATERIALES

 Muestra biologica

- Leche

 Materiales de laboratorio

- Lamina porta objetos

- Ansa calibrada
- Lamina patrón de breed
- Microscopio
- Lamina patrón para microscopio
- Colorantes: gram, azul de metileno
- Mechero

IV. PROCEDIMIENTO

1. Tratamiento de la muestra: Se debe homogenizar la muestra de leche

20 veces.

2. La muestra se extiende sobre una lámina porta objetos que esta

sobre una lámina patrón de breed al carecer de ella se coloca una
lámina de cartón que tenga una cuadrado de 1 cm 2. Con el ansa
calibrada se extiende los 0.01 ml de la muestra por toda el área del
cuadrado de la lámina patrón
 3. Dejar secar a temperatura ambiente

4. Teñir la película por el Método de Gram y otro por tinción simple con
azul de metileno.

5. Calcular número de microorganismos realizando la lectura en 30

campos microscópicos, para ello se debe de aplicar la siguiente
formula:
x= X × 100× FM

 x = número total de microorganismos

 X = numero promedio de microorganismos por campo
 FM = factor microscópicos

6. Calculo del factor microscópico

 Determinar el área del campo en mm2; aplicando la fórmula de

superficie del círculo:
Ao = π r2

 Diámetro del campo : 0.171 mm

 Área del campo = πr2 = 3.14 x (0.171/2)2 =0.023 mm2=0.00023 cm2

 Con el área del campo (en cm 2) hallado, podemos hallar el FM.
Dividiremos el Área de la preparación (1 cm 2) entre el campo
hallado, este dato vendría a ser el número de campos por frotis. X=
1 cm2/0.00023 cm2 = 4347

V. RESULTADOS

TINCIÓN GRAM TINCIÓN CON AZUL DE METILENO

 Campo Numero de Campo Numero de
observad microorganismo observad microorganismo
o por campo o por campo
1 6 1 1
2 5 2 3
3 4 3 6
4 9 4 9
5 7 5 11
6 5 6 5
7 3 7 5
8 6 8 8
9 10 9 2
10 8 10 2
11 6 11 7
12 3 12 6
13 8 13 3
14 5 14 1
15 6 15 1
16 4 16 8
17 8 17 6
18 4 18 3
19 3 19 3
20 9 20 3
21 2 21 8
22 7 22 7
23 6 23 1
24 6 24 5
25 1 25 9
26 5 26 2
27 11 27 6
28 3 28 4
29 2 29 8
30 2 30 8
  PROMEDIO DE MICROORGANISMOS POR CAMPO:

Promedio de m.o. por Σm.o.

=
campo Nº de campos

Promedio de m.o. por 315

campo = 30

Promedio de m.o. por

10.5
campo =

 Nº de m.o. en muestra = X ×100 × FM

10.5 x 100 x 4347=4,564,350 m.o. por ml de leche.

CUESTIONARIO

1. Que otros colorantes se emplean para realizar el método de Breed.

- Se puede utilizar un microscopio de fluorescencia, en el cual se utilizará un tipo de

colorante distinto (fluorenscentes) como el azul de anilina modificado.
- Las células viables se pueden diferenciar de las no viables, para eso se puede
usar la naranja de acridina (0,01%), este es el método de recuento directo con
naranja de acridina (AODC).
- También se pueden usar coloraciones por los métodos de Levowitz–Weber o
Broadhurst–Paley que permiten observar específicamente células somáticas en
leche.

2. Para que otros alimentos se puede utilizar el método de Breed.

Principalmente se analizan alimentos de tipo líquido:

 Leche pasteurizada.
 Leche no pasteurizada
 Leche Cruda O Bronca (De Establo).
 Vino Caducado.
 Sidra.

3. Como calcular el factor microscópico

  Se mide con exactitud el área del microscopio en mm2.
 Luego se divide 100 entre el área encontrada (X = 100 x Acampo).
 Luego, para hallar el factor microscópico se multiplica este valor hallado
por 100 (FM = X x 100)

VI. CONCLUSIÓN

 Utilizando el método de Breed se determinó el número de

microorganismos promedio en una muestra leche, la que dio como
resultado 4,564,350 m.o. por ml de leche.
 El método de Breed Se trata de un método para el "recuento de totales",
dado que se contabilizan los microorganismos vivos y muertos.

VII. BIBLIOGRAFÍA

 DAVILA F., Nuria y J. E., HERNANDEZ G. (2006) Métodos de ensayos rápidos de

detección de microorganismos en la leche. Revista Electrónica de Veterinaria
REDVET, Vol. VII, Nº 07, obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf

 Pedro Miguel Palacios Farfán.Método de Breed Recuentos directos al

microscopio (Microbiología de los Alimentos) obtenido de:
https://es.scribd.com/presentation/315196086/Metodo-de-Breed-pptx

 GUERRA RODRIGUEZ, V. (2005). La mastitis y sus pruebas diagnósticas. Obtenido

el 19 de enero de 2008 en
http://www.engornomix.com/la_mastitis_sus_pruebas_s_articulos_935_GDL.htm

 Benjamin/Cummings Science Publishing .Collins C.H. y Lyne Patricia M.

1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp