PRÁCTICA N° 5

INOCULACIÓN DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y DOSIS LETAL 50

I. Introducción:
Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante más de
15 años. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por
primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un
medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo además un
medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos
en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo.
También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus,
pues estos animales tienen un periodo de incubación mas prolongado que el
pollo; pero como regla, sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de
incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de
incubación).
Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión;
por consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus
crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la
parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion
tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico
del virus.
El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea,
dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la
influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en
la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica
fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después
de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados
para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la
membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse
directamente el virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la inoculación
intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus
dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los
líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P.
ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión
y en las células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego
puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los
de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea,
siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre
dicha membrana. Al moler y deshacer en una solución salina isotónica las
membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo
puede provocar la muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir
pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela,
vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej.
influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2).
En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por
la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de
pústulas contadas con la dilucion viral inoculada.
Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es
la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o
huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los
centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5
huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días.
Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que
queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4 ºC y el líquido
alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta
actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de
virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción
negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.
Entre los lugares de inoculación tenemos:
Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y
la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el
aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la
enfermedad de Beyer (Pseudorrabia); que provocan focos o pústulas
fácilmente visibles.
Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la
cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el
endodermo alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis
infecciosa, encefalitis equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis.
Ventaja: simplicidad de la inoculación y toma de muestra
Cavidad Amniótica: Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad
de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad de los mismos depende
fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.
Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la
cantidad de inóculo es de 0.2 – 1 ml. Vía es sumamente adecuada para el
aislamiento y cultivo de los virus de enfermedades venéreas, neumonía y
rickettsias. El vitelo es empleado para la preparación de vacunas y como
antígeno para reacciones serológicas de los virus ya mencionados.
Vía Intravenosa: La membrana corialantoidea está irrigada por vasos
sanguíneos, es susceptible de inoculación para casos especiales, virus que
ocasionan cambios hematológicos; por ejemplo, virus de la Leucemia. Son
empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.02 -
0.05 ml.
Vía Intracerebral (embrión): Se emplea embriones de 8 – 14 días,
específicamente para virus que producen alteraciones cerebrales: la rabia,
herpes, etc; 0.01 – 0.02 ml.

La finalidad de esta práctica es presentar la técnica de inoculación de virus en

huevos embrionados y las diferentes vías de inoculación. Siendo un tema
agregado la determinación de la dosis letal 50, que se emplea para valorar las
vacunas.

II. Objetivo:
 Conocer y aplicar correctamente los métodos adecuados para realizar
inoculaciones de virus en embriones aviares.

 Determinar la dosis Letal 50 (DL50).

1
III. Materiales:
Material Biológico:

 Virus de New Castle cepa “La Sota” a virus vivo.

 20 Huevos embrionados de gallina de 9 a 11 dias.

Material de Laboratorio:
 Ovoscopio.
 Tijera Quirúrgica.
 Agua Destilada.
 Azul de Metileno.
 Agujas Hipodérmicas.
 Placas Petri amplias.

IV. Procedimiento:

A. Tecnica de inoculación en huevos embrionados:

 Observar en el ovoscopio si el huevo es fértil o infértil.

 Determinar la edad del embrión.
 Localizar la cámara de aire y marcarla.
 Marcar el embrión.
 Colocar los huevos fértiles en un porta huevos
 Limpiar la cáscara (con una torunda de alcohol yodado, todo,
sobre todo, la parte donde se va a inocular y luego, limpiar con alcohol).
 Agujerear el cascarón con un taladro (dependiendo de donde se
vaya a inocular).
 Inoculamos el virus.
 Tapamos el agujero con parafina (o cera de vela).
 Luego llevamos a estufa (controlar temperatura y humedad
adecuada)
 Controlar, observar dos veces al día, para percatarse si están
vivos o muertos.

B. Otras Formas De Inoculación:

Inoculación en el Saco Vitelino:

 El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión.
 Observar al Ovoscopio y marcar el límite de la cámara de aire,
marcando con un aspa la posición del embrión. La cámara de aire debe
estar en el polo.
 Realizar un agujero en el límite de las ¾ partes del huevo.
 Tomar el inoculo con aguja de inoculación N° 22 con una jeringa
de tuberculina.
 Inocular en el agujero hecho en posición directa al embrión con
ángulo de 90°.

Inoculación en la Cavidad Alantoidea:

 Colocar el huevo con posición vertical y con un taladro hacer un
orificio en posición directa del embrión.

2
  Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de
45° en el borde (en relación al polo de la cámara de aire); introducir las 1½
pulgadas.
 Otra forma es marcar la cámara de aire a 0.5 cm. de la cámara de
aire hacer un agujero e inocular 0.3 ml. de inóculo con aguja 26 ó 27 de
tuberculina. Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en posición
contraria al embrión e inocular.

Inoculación en la Cavidad Amniótica:

 Practicar un agujero en posición directa al embrión; con aguja 22
de 1½ pulgadas. Inocular directamente al embrión, introduciendo toda la
aguja.
 Podemos también abrir toda la cámara, añadir 1 gota de suero
fisiológico ó agua destilada, para que la membrana fárfara; que inicialmente
es blanca se haga transparente, introduciendo pinza y levantar la
membrana de la cavidad amniótica, observar al embrión e inocular (la
membrana es el amnios).

Inoculación en la Cavidad Coriolantoidea:

 Se practica un agujero en el polo más ensanchado del huevo para
inocular :

o Utilizando la cámara natural, inoculando por

debajo de fárfara que cubre, depositando el líquido sobre la membrana
corioalantoidea, usando jeringa de tuberculina y aguja 26 ó 27.
o Fabricando una cámara de aire artificial,
practicar dos agujeros; uno en el polo más ensanchado y otro en uno
de los costados del huevo en posición contraria al embrión. Colocar un
torniquete en su boquilla y obtener el aire del polo más ensanchado
(cuando sale el aire). La membrana cono alantoidea baja; es decir
este se separa más de la cáscara.
 Evitar abrir demasiado para que no se contamine.
 Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 ó 27 x 1 ó ½ pulgada.
Para inocular se introduce el basal de la aguja y enseguida se inocula el
fluido, en la inoculación se puede girar la jeringa para que el líquido, quede
depositado en la membrana, los agujeros son cubiertos con parafina o cera
(después de haber realizado las inoculaciones

IV. Resultados:

Observación de huevos en el
ovoscopio

3
 Inoculación de los huevos

Incubación de los huevos inoculados. Se observa su

viabilidad durante una semana

- En la práctica, con la inoculación de los

virus New Castle se realizo una ensayo de Dosis letal 50%,.
- Como trabajo, se nos pidió realizar un
ejemplo de DL50 y su breve explicación.

La dosis letal 50 es la cantidad de una sustancia expresada en gr o mgr

capaz de matar al 50 % de los animales inoculados. La DL50 es una medida de
uso común en Toxicología y en Farmacología, también se aplica para el cálculo
de título de un virus que en ese caso sería la cantidad de virus necesaria para
matar al 50% de la población. En algunos casos suele usarse la DL25 o la
DL75.
Estos son ensayos donde no se cuenta el número de partículas
infecciosas presentes en el inóculo, pero en su lugar se obtiene un valor para el

4
título de ese virus donde la medida está basada en el principio de todo o nada
(hay efecto citopático o no?, está el animal vivo o muerto?). Además esta se
utiliza en virus que sean capaces de matar el 50% de la población de animales.
El título viral es definido como aquella dilución de virus que infecta (o
mata) el 50% de la población inoculada.
En estos análisis para determinar el título viral, se utiliza el método de
Reed y Muench, el cual es relativamente simple, la fórmula que se utiliza es la
siguiente:

(% infectividad en la dil. Inmediata superior a 50%) - 50%

Distancia
(% infec. En dil. Inmed. Sup. a 50%) – (% infec. En dil. Inmed. =
proporcional
Inf. A 50%)

- Ahora, para calcular la dosis letal 50 se

utiliza la sgte. fórmula:

CDL50 = - Log (dil. más cercana y por encima de 50% ) + DPfd

- Ahora tomenos los siguientes datos:

Relación Acumulación de valores

Dilución Huevos vivos muertos mortalidad Tm Ts Mortalidad
Relación %
10-1 4 0 4 4/4 13 0 13/13 100%
10-2 4 0 4 4/4 09 0 09/09 100%
10-3 4 1 3 3/4 05 1 05/06 83%
10-4 4 2 2 2/4 02 3 02/05 40%
10-5 4 4 0 0/4 00 7 00/07 00%

Entonces el cálculo de la dosis letal 50 sería:

1) Primero, ya que tenemos las relaciones de huevos vivos y

muertos y los porcentajes de mortalidad respectivos, ahora
hallamos la distancia proporcional:

 Los números más próximos y que estén por encima

y por debajo del 50% son: 67% y 36%, entonces,
aplicamos fórmula:
83 – 50 33
= = 0.8
83 - 40 43

2) Ahora hacemos el cálculo de la dosis letal 50 (CDL 50),

entonces aplicamos fórmula:

CDL50 = - Log (10-3) + 0.8

5
 CDL50 = - (-3) Log10 + 0.8

CDL50 = 3 + 0.8

CDL50 = 3.08

3) Entonces, como el cálculo de la dosis letal 50 es 3.08, el

logaritmo del título de la dilución será:

Log DL50 = 10-3.08

V. Conclusiones:

Debido a la mala manipulación se hicieron determinados ajustes para
calcular la dosis letal 50 la cual dio como resultado Log DL50= 10-3.08

A través de la inoculación seriada de los huevos embrionados y
controlando cuantos mueren por cada dilución se puede formar una
tabla que nos serviría para poder hallar la dosis letal 50.

VI. Referencias:

- ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F.

- MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de los
Microorganismos. 8º Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F.
- PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 4º edic.
Edit. Mc Graw Hill Mexico D.F.