UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS
Profesor encargado (a): Susana Gutiérrez

Alumnos: Códigos:

Lima-Perú
 I. Introducción

Los microorganismos son parte fundamental de la vida del planeta. Para comprender su
función en los nichos específicos, es esencial identificar y cuantificar cada uno de los
miembros que conforman estas comunidades, así como las actividades metabólicas que
presentan. La detección e identificación de estos microorganismos permite inferir sobre la
diversidad poblacional en la muestra analizada o el estado de salud del consumidor. Por otro
lado, este conocimiento puede ofrecer, el aprovechamiento de cepas o de metabolitos
microbianos en procesos biotecnológicos.  

El crecimiento de los microorganismos presentes en sustratos que se encuentren en

condiciones que lo propicien, se traducirá primero en el aumento de los componentes
celulares, y en seguida por el aumento del tamaño y el incremento del número de células.
Dependiendo del tipo de muestra y análisis es necesario conocer el número de unidades
formadoras de colonias (UFC) presentes, este número es tomado en cuenta para cumplir los
estándares establecidos bajo normatividad en el área de los alimentos, en el área de salud,
análisis de agua, aire y suelo entre otros.  Los estudios relacionados con el análisis de
muestras como agua, alimentos, leche y aire requieren de una enumeración cuantitativa de los
microorganismos presentes en estos compuestos, ya que la calidad microbiológica de estos
productos está en relación directa con la calidad sanitaria y la seguridad para el consumo de
ellos. Por lo heterogéneo de los microorganismos y de las muestras, existen muchos métodos
para tales fines que incluyen métodos microscópicos o directos.

En este informe se describirán algunos métodos de conteo de microorganismos practicados en

clase, tanto de forma directa como indirecta, explicando las particularidades de cada uno y
dando a conocer los resultados obtenidos en estos.
 II. Métodos directos

a) Recuento por el método de las placas

Para la realización del recuento por el método de placas se hizo uso de una muestra de
leche de establo sin esterilizar, la cual fue tratada siguiendo rigurosamente los pasos
indicados en la guía, para posteriormente proceder a determinar el número de unidades
formadoras de colonias existentes en el medio de cultivo. A continuación, se indican los
resultados, discusión y conclusiones obtenidas de esta experiencia.

Resultados

Tras la incubación de las tres placas realizadas placas se observó el crecimiento de

colonias tanto dentro como en la superficie del agar, todas estas con características
morfológicas similares: Circulares, de color blanquecino, borde entero y coloración
opaca. Aunque sí se observó diversidad en el tamaño de las colonias siendo visibles tanto
ejemplares puntiformes como algunos de hasta 5 mm de diámetro, relacionado a esto, se
percibió en todas las placas una preponderancia de UFC de tipo puntiforme en
comparación con las de tamaño medio, aproximadamente 1-3mm, y una cantidad mínima
de UFC de tamaño superior a 3mm.

Tras realizar los conteos respectivos se calculó una cantidad mayor a 300 UFC en la placa
de dilución 10-3, 168 UFC en la placa de dilución 10 -4 y alrededor de 90 UFC en la placa
de dilución 10-5.
.

Figura 1. Colonias bacterianas aisladas de la dilución 10−3

 Figura 2. Colonias bacterianas aisladas de la dilución 10−4

Figura 3. Colonias bacterianas aisladas de la dilución 10−5

Conteo de UFC

Para realizar el conteo se utilizó la siguiente expresión:

N° UFC de la placa: (N° de colonias x factor de dilución) / volumen utilizado.

(expresado en UFC/ml)
Reemplazando datos:

N° UFC de la placa: (168 x 1 x 104 ) / 1

N° UFC de la placa: 1,68 x 106

N° UFC de la placa: 1,7 x 106 UFC/ml (resultado con dos cifras significativas)

Discusión de resultados

Teniendo en cuenta el intervalo de análisis 30-300 UFC, la disolución 10−3 fue descartada
porque sobrepasaba el máximo, la disolución 10−5 , si bien presentaba un número mayor a 30,
al momento de adecuar el número de colonias también sobrepasaba el máximo. En cambio la
disolución 10−4, fue la disolución más adecuada para realizar el conteo, por ello se realizó el
cálculo del número de bacterias obteniéndose 1,7 x 106 UFC/ml. Haciendo una comparación
con la información obtenida de Digesa, principalmente con la leche pasteurizada, cuyo rango
varía entre 1- 10 ml, la cantidad de bacterias sobrepasaría en demasía este rango.

Conclusiones

 Se concluye que el conteo de placas como método directo, es adecuado cuando de

determinar colonias vivas de bacterias se trata. En contraposición, no es posible
determinar qué tipos de bacterias son las que se están contando.
 No sería adecuado cuando se necesite analizar rápidamente la presencia de
microorganismos de un producto a evaluar, porque el tiempo que se requiere para
el crecimiento bacteriano no es el mismo que el tiempo de espera de un producto a
analizar.
 Permite evaluar si se han realizado las condiciones higiénicas adecuadas en la
elaboración de algún producto a analizar.

b) Recuentos por conteo directo

Las cámaras de recuento directo posen una depresión central de profundidad conocida en la
que se coloca un volumen conocido de cultivo, enumerando individualmente las células por
control microscópico. Estas cuentas se pueden hacer también en frótices teñidos en láminas,
en este procedimiento es esencial calibrar el microscopio de modo que se conozca de
antemano el área de campo microscópico.

Resultados

Luego de depositar un volumen de cultivo sin diluir de E. coli (Factor de dilución =1) sobre
la cámara de Neubauer, se observó al microscopio a diferentes aumentos como se muestran
en las siguientes imágenes:

Figura 4. Oberservación de la Cámara de Neubauer al microscopio compuesto.

Aumento 250X
 Figura 5. Oberservación de la Cámara de Neubauer al microscopio compuesto. 16
cuadrados pequeños con aristas de 0,05 mm y una superficie de 0,0025 mm2.
Aumento 400X

Cálculos

 Aplicando la siguiente fórmula se puede calcular el número de microorganismos por

ml:

¿ de bacterias∗factor de dilución∗a∗10 4
N ° de cuadros contados

Donde a= 400 si se cuentan los cuadrados más pequeños (cuadrados del aumento
400x)

 Haciendo el recuento cuando a = 400 y reemplazando los datos en la fórmula, se

obtiene:
579∗1∗400∗104 7
=19.3∗10 UFC /ml
12
Discusión de Resultados

El método de conteo por la cámara de Neubauer nos permite una hallar la concentración de
los microorganismos de una manera directa en un volumen establecido, observando los
organismos al microscopio compuesto. Estos se pueden observar sin la necesidad de aplicar
técnicas de tinción, sino nada más con el contraste de luz del microscopio, por lo que este
método el uso de cámara de recuento como la de Neubauer representa un método simple
rápido y con mínimo requerimiento de equipos.

Por otro lado, entre las desventajas de este método se podría mencionar que las UFC que se
observan al microscopio y que forman parte del recuento no siempre son microorganismos
vivos por lo que el recuentro se encontraría con cierto porcentaje de error. Así mismo, este
método no te permite observar microrganismos muy pequeños por lo que algunas células no
son tomadas en cuenta en el proceso.

III. Métodos indirectos

a) Métodos turbidimétricos

Método para estimar de forma indirecta, el número aproximado de microorganismos por mL

presente en cultivo líquido.

Se realiza mediante una comparación visual de mi muestra con una serie de tubos de
diferentes turbiedades (escala de McFarland)

Resultados

Tres tubos de ensayo con cultivos en caldo de: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y
Staphylococcus aureus, se ubicaron de acuerdo con intensidad de turbidez junto a una serie
de patrones de turbidez previamente calibrados.
 Figura 6.

CUADRO I: ESCALA DE McFARLAND

TUBO N° ClBa (1%) H2SO4 (1%) MILLONES DE

m.o./ml
1 0.1 9.9 300
2 0.2 9.8 600
3 0.3 9.7 900
4 0.4 9.6 1200
5 0.5 9.5 1500
6 0.6 9.4 1800
7 0.7 9.3 2100
8 0.8 9.2 2400
9 0.9 9.1 2700
10 1.0 9.0 3000

TUBO N° Staphylococcus E. coli / Pseudomonas

1 379 379
2 758 757
3 1137 1136
4 1516 1515
5 1895 1894
6 2273 2272
7 2652 2651
8 3031 3030
9 3410 3408
10 3789 3787

Figura 7.
Uso de la escala de McFarland para realizar la comparación visual de los cultivos de
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus.

Mediante comparación visual se obtuvo resultados para cada cultivo, buscamos la

equivalencia en la tabla para cada cultivo, hallamos el número aproximado de
microorganismos por ml. Para cultivo de Escherichia coli existen aproximadamente 2272 x
106 m.o./ml, para Pseudomonas aeruginosa existen aproximadamente 1894 x 106 m.o./ml y
para Staphylococcus aureus existen aproximadamente 1137 x 106 m.o./ml.

Discusión de resultados

Analizamos la turbidez con la escala de McFarland, después de comparar con los patrones
de turbidez, estos ya se encontraban listos.
Los patrones de McFarland se preparan añadiendo ácido sulfúrico a una solución acuosa
de cloruro de bario que produce la formación de un precipitado de sulfato de bario
suspendido.
Para cultivo de Escherichia coli existen aproximadamente 2272 x 106 m.o./ml, para
Pseudomonas aeruginosa existen aproximadamente 1894 x 106 m.o./ml y para
Staphylococcus aureus existen aproximadamente 1137 x 106 m.o./ml., lo cual según la tabla
nos indica una cantidad aproximada, pero no es el adecuado puesto que posee amplio margen
de error.

La turbidez de un cultivo depende de la especie bacteriana, de la cepa, del tamaño, forma de

las células, del medio que se utilice en el estudio, así como también de las condiciones
ambientales. Además, la exposición del patrón a la luz durante el almacenamiento puede
afectar las mediciones de turbidez.

La turbidez también se determina por la densidad óptica (DO) que puede ser expresada como
absorbancia, la cual se mide en el espectrofotómetro, se la relaciona con la ley de Lambert-
Beer en donde la turbidez es proporcional a la concentración de partículas. Se debe
mencionar que la principal desventaja de usar la densidad óptica para un modelo predictivo
en el crecimiento celular es que no se puede tomar como una medida directa de viabilidad
celular, ya que tanto las células viables como las no viables absorben a una longitud de onda
especifica (Davies & Smith, 2001; Hoffman & Preetham, 2002; Jenkins & White, 1965)

Conclusiones

 Se utilizan para realizar una estimación del número de bacterias totales, tanto viables
como no viables.
 Es una forma práctica de monitorizar el crecimiento bacteriano, por ello es necesario
estimar turbidez.
 Durante la última década se ha diversificado el uso del método turbidimétrico en áreas
como, la agricultura, el medio ambiente, la salud, etc., potenciando el desarrollo de
aplicaciones y equipos para el diagnóstico microbiológico.

b) Recuentos por el método del número más probable

Se realizaron diluciones seriadas de leche hasta obtener la dilución de 10-5; posteriormente

cada dilución fue colocada en tres tubos diferentes en un caldo verde brillante.

Resultados
En el grupo de tubos en el que se colocó la leche diluida en 10 -3 (Fig. a) se obtuvieron los tres
medios con un grado notable de turbidez, así que todos fueron considerados positivos. De la
misma manera, se observó turbidez en los tres tubos de los medios con dilución 10 -4. Por otro
lado, en los tubos con la dilución 10-5 no se distinguió turbidez, por lo tanto, a ningún tubo se
le consideró positivo.

10-3 10-4 10-5

Figura 8. Tubos con leche diluida en 10-3, 10-4 y 10-5 en caldo verde
brillante. En el primer grupo de tubos se consideraron tres positivos; en el
segundo, tres; y en el último grupo ninguno.

Luego de ubicar los números obtenidos en una tabla de NMP con un intervalo de confianza
de 95% se determinó el NMP como 200. Este valor fue multiplicdo por 10 2 para convertir el
resultado a mL. De esta manera, se determinó una cantidad de bacterias en un mililitro de
leche era igual a 20000.

Discusión de resultados

Mediante el método del NMP, se puede afirmar experimentalmente la existencia de una

relación entre el número de células y el grado de turbidez del medio. Esto se debe a que las
células dispersan la luz que ingresa al tubo, y a mayor número de células, es mayor la
cantidad de luz desviada (Mandigan, 2015). Cabe destacar que, ya que no se realiza un conteo
exacto, sino una aproximación, los métodos basados en la turbidez del medio son
considerados métodos indirectos de conteo.

El medio utilizado fue un caldo verde brillante, el cual permite el desarrollo de bacterias
como E. coli, P. aeruginosa, S. albus y A. faecalis. No obstante, también se pueden emplear
medios selectivos para determinar el número de una bacteria específica.
El motivo por el cual se deben realizar diluciones en este método es para no obtener todos los
tubos demasiado turbios, sino que el grado de turbidez esté distribuida en algunos tubos y
ausente en otros. De esta manera se puede asegurar encontrar el valor correspondiente en las
tablas de NMP, y el número de bacterias por mL indicado en estas se aproxime al número
real.

Este método se basa en estadísticas, lo cual implica la presencia de un margen de error, y que
será menos significativo a cuanto mayor sea el número de tubos analizados (Dehority, 1989).
Esto sugiere que los resultados obtenidos tuvieron un ligero margen de error, ya que solo se
incubaron tres tubos por dilución.

En gran parte de los tubos se observaron partículas sedimentadas, las cuales podrían
corresponder a cuerpos celulares depositados. Esto suele suponer un problema en la mayoría
de los métodos turbidimétricos, en este caso, si no se hubiera tomado en cuenta el sedimento
y si no se hubiera agitado un poco cada tubo, probablemente no se hubieran considerado
como positivos aquellos tubos con un alto nivel de turbidez, lo cual hubiera conducido a un
error considerable (Oblinger, 1975). Para evitar problemas en este punto, es mejor utilizar
medios líquidos, en los que la turbidez pueda ser distribuida, en vez de medios sólidos
(Oblinger, 1975).

Otro problema que podría alterar los resultados es el tamaño de las bacterias presentes, ya que
un mayor tamaño involucraría que una menor cantidad de células desvíen mayor cantidad de
luz generando un medio más turbio. Asimismo, si el contenido proteico es muy elevado, se
observará el medio con mayor claridad (Oblinger, 1975).

Conclusiones

El método del número más probable es un método de conteo indirecto que permite aproximar
el número de bacterias por mL. Este, pese a ser un procedimiento de menor costo y cuya
estimación es considerablemente más rápida que la de otros métodos, no es el método más
exacto para conteo de bacterias, pues suele tener un margen de error que depende del número
de diluciones y tubos realizados por dilución.
 IV. Cuestionario

1.- ¿Cuál de los métodos de enumeración le parece el más exacto?

Consideramos al método de conteo directo como el método más exacto debido a que
presenta mayor especificidad en los resultados y, al no involucrar muchos otros pasos
para seguir ni materiales, posee una menor probabilidad de cometer algún error en
alguna parte del procedimiento.

2.- ¿En qué casos se emplea la Escala de Mac Farland?

Los estándares de McFarland son patrones de turbidez basados en suspensiones de

sulfato de bario.
La escala de McFarland consta de 11 patrones (desde 0,5 a 10) cada uno de los cuales
tiene una turbidez comparable a la de una suspensión bacteriana con una densidad
determinada.
Para estimar la densidad bacteriana de una suspensión se compara visualmente su
turbidez con la de los patrones realizados en la escala de McFarland, utilizando un
fondo de contraste.

Esta escala es adecuada solo si se trata de un cultivo que contiene una sola clase de
bacterias. La capacidad de retención de luz (turbidez) que se compara depende del
tamaño, forma y transparencia de la bacteria, por lo tanto solo tendrá relación con la
cantidad de microorganismos si el cultivo evaluado es puro.

V. Referencias

- Dehority B., Tirabasso P., Grifo A. (1989) Most-Probable-Number Procedures for

Enumerating Ruminal Bacteria, Including the Simultaneous Estimation of Total and
Cellulolytic Numbers in One Medium. Appliead an Evironmental Microbiology; 55
(11): 2789-2792.

- Madigan M., Martinko J., Bender K., Buckley D., Stahl D. (2015) Brock. Biología de los
microorganismos, 14 edición, Madrid, Pearson.
- Oblinger J. Koburger J. (1975) Understanding and Teaching the Most Probable Number
Technique. J. Milk Food Technol; 38 (9): 540-545.

- The hemocytometer (counting chamber), June 27, 2010 Recuperado de

http://www.microbehunter.com/the-hemocytometer-counting-chamber/

- Sagar Aryal (2019). Direct Microscopic Counts. Recuperado de:

https://microbenotes.com/direct-microscopic-counts/

- http://www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/Proy_RM615-2003.pdf