PRACTICA Nº3

DETERMINACIÓN DE BACTERIAS VIABLES POR EL MÉTODO DE REDUCCIÓN

DE COLORANTE

I. INTRODUCCIÓN

El desarrollo de métodos rápidos y/o automatizados en el diagnóstico de la calidad

higiénico sanitaria de la leche y sus productos constituye en los últimos años una
necesidad enfocada en lo fundamental en la obtención de la respuesta en el menor
tiempo posible para tomar las medidas correctivas sobre las posibles brechas en la
higiene de algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea
liberado en el mercado.

Estos métodos rápidos de diagnóstico bacteriológico en leche se han clasificado

atendiendo a diferentes puntos de vista, no obstante, en lo fundamental han tomado
como base los aspectos siguientes: Rapidez con que se obtienen las respuestas, la
actividad metabólica de los microorganismos, posibilidades de automatización y
principios de medición en que se basan las lecturas. Teniendo en cuenta la diversidad
de estas clasificaciones y para una mayor inclusión de métodos rápidos empleados en
el diagnóstico microbiológico de la leche, están agrupados en tres grupos: métodos
directos, indirectos y en métodos para diagnóstico de microorganismos específicos. El
método usado en esta práctica es un método indirecto, el método de reducción de
colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.

Método de reducción de colorante Azul de metileno: mide en in intervalo de tiempo

requerido, la decoloración de la mezcla colorante-alimento (leche) de un color
característico azul, hasta incoloro (blanco en caso de la leche). Se tiene en cuenta el
factor tiempo y la temperatura de incubación.

El principio de la prueba de reducción con azul de metileno se basa en que el potencial

de óxido reducción (Eh) de la leche fresca aireada es de +0.35 a +0.40 voltios, el cual
se debe principalmente al contenido de O2 disuelto en el producto. Si por cualquier
causa ese O2 es separado, el Eh disminuye. Esto ocurre cuando los microorganismos
crecen en la leche y consumen el O 2. Si el número de microorganismos es muy
elevado, el consumo de O2 será mayor y por consiguiente el Eh caerá rápidamente; si
por el contrario, el número de microorganismos es pequeño, el Eh disminuirá
lentamente.

El principio anterior encuentra aplicación en la determinación de la calidad sanitaria de

la leche, utilizando como indicador de óxido-reducción al azul de metileno, este se
presenta de color azul en su forma oxidada y es incoloro en su forma reducida. En
solución acuosa de pH 7,0 su oxidación es completa a Eh +0.075 voltios y su
reducción es completa a Eh -0.015 voltios.

En la leche, por existir un pH menor de 7 (6.5 – 6.7), la reducción completa del azul de
metileno ocurre a un Eh más positivo, habiéndose demostrado que esto tiene lugar a u
Eh entre 0.075 a +0.225. El tiempo en horas que tarda en pasar el azul de metileno de
su forma oxidada (azul) a la reducida (incolora) bajo condiciones controladas es
proporcional a la calidad sanitaria de la leche y aunque no es posible establecer con
exactitud el número de microorganismos, es factible clasificar el producto dentro de
ciertos grados aceptables o inaceptables.

Debe tenerse en cuenta que existen factores que pueden afectar el tiempo de
reducción, entre ellos el tipo de microorganismo, el número de leucocitos, el periodo
de exposición a la luz, la cantidad de O2 disuelto y la tendencia de la leche a elevar los
microorganismos hacia la superficie a medida que se va separando la crema en el
tubo de prueba. Es así como ciertos microorganismos (Lactococcus lactis) son más
activos en su capacidad reductora que otros, mientras que existen algunas especies
que son muy poco activas en este sentido (Streptococcus agalactiae, Bacillus subtilis,
microorganismos termodúricos). Por otra parte, a medida que aumenta el número de
leucocitos en la leche y su exposición a la luz natural o artificial, el tiempo de reducción
tiende a reducirse, mientras que la agitación y la tendencia de la crema a ascender
(arrastrando los microorganismos) son factores que tienden a retardar el tiempo de
reducción.

II. OBJETIVOS

 Determinar a calidad de la muestra de leche

 Determinar las células viables presentes en la muestra de leche a partir

de la prueba de la reductasa.

III. MATERIALES

 Muestra biológica:

 leche

 Material de laboratorio

 Tubos con tapa rosca

 Pipetas
 Azul de metileno
 Baño de agua a 37ºC
 Gradias
IV. PROCEDIMIENTO

1. Preparamos y verificamos que el baño de agua se encuentre a 37ºC esto

se realiza colocando un tubo con leche se coloca el termómetro y
determinamos la temperatura correcta.

2. Homogenización de la muestra 20 veces

3. Colocar en el tubo 10 ml de leche y 1 ml de azul de metileno y mezclar

dos veces

Tubo con 10 ml de leche +

Tubo con 10 ml de leche
1ml de azul de metileno
 4. Colocar el tubo con la muestra en una gradilla la cual se colocara en un
baño de agua (el agua del baño tiene que cubrir el contenido del tubo).

5. Efectuar la lectura cada 30 minutos y Anotar el tiempo que demore en

virar de color de la muestra, según los resultados se interpreta de la
siguiente manera:

Tiempo Calificación de la muestra Numero de

microorganismos/ ml
> 4 horas Muy buena, clase A < de 500 000

Entre 3 a 4 horas Buena, clase B 500,000 a 4 000 000

> 30 min y < 3 horas Aceptable 4 a 20 millones

< 30 minutos Inaceptable > de 20 millones

V. RESULTADOS

 La muestra de leche a la cual se le agrego 1 ml de azul de metileno y se colocó

en baño de agua a 37ºC y se decoloro después de 4 horas.
 muestra control control muestra

Lectura de la muestra los primeros 30 Lectura de la muestra después de 2

min: persiste la coloración azul horas : persiste la coloración azul

Muestra decolorada
después de 4 horas

VI. CONCLUSION

A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el método para la

realización de la prueba de la decoloración del colorante azul de metileno o
prueba de la reductasa bacteriana. Esta prueba resulta muy útil a la hora en
la industria láctea puesto que la velocidad a la que se produce el cambio de
color del indicador azul de metileno es directamente proporcional al número
de gérmenes presentes. De esta manera se puede determinar de manera
indirecta la calidad higiénica de la leche. Se puede concluir que la muestra
analizada califica como una leche “Muy buena” (Clase A), lo que nos indica
que había suficiente cantidad de O2 en la muestra para que se realice una
oxido reducción completa después de 4 horas desde el inicio de la Prueba.

VII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué otros colorantes se emplean para la determinación de

microorganismos viables?

El colorante más empleado en la industria láctea para realizar esta prueba

es el azul de metileno, pero también se pueden utilizar la resazurina y el
cloruro de 2, 3, 5, trifenil-tetrazolium, ya que son colorantes fácilmente
 absorbibles por las células vivas y se decoloran a una velocidad
proporcional a la actividad de las reductasas microbianas.

2. ¿Para qué otras muestras liquidas se utiliza el método de reducción

del colorante?

Además del uso de este método para productos lácteos (líquidos), también
puede ser usado para otros alimentos como por ejemplo jugos de frutas y
variedades, en los que se encuentran los jugos de soya, piña y otros, sobre
todo alimentos líquidos en los que también se podría observar el viraje de
color del azul de metileno u otro colorante a usar.

3. Formula del azul de metileno oxidado y reducido

VIII. BIBLIOGRAFIA

 Normas de Higiene para el Sector Lácteo. Control de industrias lácteas y

grasas comestibles. Ed. Instituto de Salud Pública. Dirección General de
Salud Pública y Alimentación. Madrid. 2007.

 Manual de Procedimientos para Análisis de Calidad de la Leche. León,

Nicaragua. Agosto de 2010. Cuenta Reto del Milenio y Technoserve.

 Guía práctica: Introducción al control de calidad de la leche cruda. 2003.

Universidad de Zulia. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de
ciencia y tecnología de la leche. Maracaibo. Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyoparapruebasd
eplataforma_1693.pdf