Universidad Nacional del Nordeste Trabajo Prctico N 5

FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS Estudio cuantitativo de bacterias

Microbiologa General- Carrera Farmacia Ao 2006

Trabajo Prctico N 5
Estudio cuantitativo de bacterias

RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA

Es un mtodo muy utilizado cuando se necesita determinar el tamao de la poblacin bacteriana de una
muestra.

El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollar una colonia visible. Pero
debido a que una muestra no es totalmente homognea con respecto a su composicin microbiolgica, es
posible que una colonia se origine de un microorganismo o de cientos de ellos, dando en este ltimo caso un
recuento menor del real.
Tambin es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan crecer en las condiciones
elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En este caso el recuento tambin ser inferior al
real. Lo que si se sabe es que cada colonia observada se form a partir de por lo menos un microorganismo.
Esta es una condicin necesaria y suficiente. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de
colonia (ufc) a los efectos de los clculos.

Se admite, por lo tanto, que en los mtodos de recuento de microorganismos vivos, son inevitables los
errores. Especialmente cuando se examinan muestras pequeas, es posible cometer grandes errores.

Tcnica Operatoria

Preparar una suspensin al 10 % de suelo en 50 ml. de agua destilada. La tierra debe estar seca y recin
recogida.

Mantener en agitacin la suspensin anterior durante 30 a 60 minutos. Puede utilizarse agitacin manual o
magntica.

Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/ 100.000 de la suspensin anterior
respetando un volumen final de 5 ml.

Se rotulan 5 placas (una para cada dilucin) sembrar 0.1 ml (con pipeta limpia en cada una) de cada dilucin
en una placa de Petri con Agar Nutritivo y con ayuda de una asa de Digralski extenderlo por toda la placa.

Incubar a 37 C durante 2- 3 das en estufa o incubadora.

Observar las placas en busca de efectos de inhibicin.

Realizar el recuento de los microorganismos presentes en la muestra del suelo. Para realizar el contaje se
escogen las placas que muestren entre 30 y 300 colonias. Para visualizar mejor es conveniente ubicar la placa
sobre una caja con tapa de vidrio y luz, dividiendo la superficie total de la placa en sectores cuadriculados.
Dar el resultado en ufc/g (no en bacterias por gramo):

Ufc/g = N de colonias en placa (entre 30 y 300) x inverso de la dilucin x 10

Lpez Tevez, Leonor; Torres, Carola

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Microbiologa General- Carrera Farmacia Ao 2006

ESTIMACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Este mtodo se basa en la presuncin de que las bacterias se hallan uniformemente distribuidas en un medio
lquido, o sea que las muestras del mismo tamao de un mismo producto tendran el mismo nmero de
microorganismos. Naturalmente las muestras contienen algunos grmenes ms o menos. Entonces la cifra
media es el nmero ms probable.

Las bacterias rara vez estn separadas de sus vecinas. Ellas se agrupan en racimos, en especial cuando se
reproducen activamente. Adems la agitacin puede deshacer o inducir a la formacin de racimos. Por lo
tanto carecen de valor las pruebas que se obtienen de una prueba aislada.

Si el nmero de grmenes es grande, la diferencia entre las muestras ser pequea, pero si es pequeo las
diferencias relativamente sern mayores.

Esta tcnica se usa principalmente para la estimacin de bacilos coliformes en caldo Mac Conkey, pero
puede ser empleada para casi toda clase de grmenes en muestras lquidas.

Es posible calcular el nmero de grmenes por cada 100 ml. con cualquier combinacin de resultados
obtenidos de tales muestras. Existen tablas para muestras de 10ml., 1ml. y 0,1 ml. utilizando cinco o tres
tubos para cada tamao de la muestra.

Tcnica Operatoria

Se mezclan las muestras mediante vigorosas sacudidas e inversiones. Si se trata de una muestra de agua
potable debe agregarse un inhibidor de cloro.

Se pipetean las cantidades mencionadas de suspensin de muestra y se colocan en tubos con 5 ml de medio
de cultivo (caldo Mac Conkey):
Tres tubos con 10 ml. (en medio reforzado)
Tres tubos con 1 ml. ( en medio simple)
Tres tubos con 0,1 ml. ( en medio simple)
Se aconseja el empleo de medios reforzados ( de doble concentracin) para grandes volmenes de muestra
para evitar que el medio se diluya demasiado.
Para observar si las bacterias producen gas los tubos con medio de cultivo deben contar con una campana de
Durham en su interior, la cual se coloca antes del proceso de esterilizacin.

Se incuban durante 24 o 48 hs. a 35- 45 C.

Lpez Tevez, Leonor; Torres, Carola

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Microbiologa General- Carrera Farmacia Ao 2006

Se observa el crecimiento considerando positivos los tubos que manifiestan turbidez, cambios de color o
produccin de gas.

Se tabulan los nmeros de tubos positivos y se consultan las tablas.

TABLA 1
Nmero ms probable en 100 ml. usando 3 tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml. de muestra

Tubos positivos Tubos positivos Tubos positivos

10 ml. 1 ml. 0.1 ml NMP 10 ml. 1 ml. 0.1 ml NMP 10 ml. 1 ml. 0.1 ml NMP
0 0 0 3 1 2 0 11 2 3 3 53
0 0 1 6 1 2 1 15 3 0 0 23
0 0 2 9 1 2 2 20 3 0 1 39
0 1 3 3 1 2 3 24 3 0 2 64
0 1 0 6 1 3 0 16 3 0 3 95
0 1 1 9 1 3 1 20 3 1 0 43
0 1 2 12 1 3 2 24 3 1 1 75
0 2 3 6 1 3 3 29 3 1 2 120
0 2 0 9 2 0 0 9 3 1 3 160
0 2 1 12 2 0 1 14 3 2 0 93
0 2 2 16 2 0 2 20 3 2 1 150
0 3 3 9 2 0 3 26 3 2 2 210
0 3 0 13 2 1 0 15 3 2 3 290
0 3 1 16 2 1 1 20 3 3 0 240
0 3 2 19 2 1 2 27 3 3 1 460
1 0 3 4 2 1 3 34 3 3 2 1100
1 0 0 7 2 2 0 21 3 3 3 1100+
1 0 1 11 2 2 1 28
1 0 2 15 2 2 2 35
1 1 3 7 2 2 3 42
1 1 0 11 2 3 0 29
1 1 1 15 2 3 1 36
1 1 2 19 2 3 2 44

ACTIVIDADES

1- Responda el siguiente cuestionario

1. Qu permite determinar el estudio cuantitativo de bacterias?

2. Qu tipo de muestras se pueden analizar? Ejemplifique.
3. En qu consiste el medio Mc Conkey reforzado y por qu se lo utiliza?
4. Mencione las limitaciones del mtodo del recuento de colonias en placa.
5. Por qu carecen de valor los resultados de una prueba aislada en NMP?
6. Describa las caractersticas observadas en los tubos donde considera que hubo crecimiento
bacteriano.
7. Teniendo en cuenta la composicin del medio utilizado para NMP, cmo lo clasificara y por qu?
8. Describa cmo obtendra una dilucin de 10-5 de la muestra a analizar

Lpez Tevez, Leonor; Torres, Carola