Guía de laboratorio de Microbiología y Parasitología

PRÁCTICO Nº 3: Medios de cultivo y Técnicas de siembra

Introducción
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el “medio de cultivo” y el crecimiento de los
microorganismos es el “cultivo”. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes,
adaptados a las necesidades nutricionales de los diferentes microorganismos.
Generalidades de medios de cultivo
Los medios de cultivo son preparados estériles que contienen sustancias necesarias para el
desarrollo de microorganismos. Algunos medios de cultivo nos ayudan en la identificación, ya que
están diseñados para revelar alguna característica metabólica distintiva del microorganismo. Por
último, los medios de cultivo también permiten conservar los microorganismos en el laboratorio
para usos futuros.
Los medios de cultivo pueden clasificarse según su consistencia en medios líquidos o sólidos. La
principal diferencia entre ellos es que el medio sólido lleva agar en su composición, una especie de
gelatina que se extrae de las algas. Los medios líquidos se presentan en tubos o matraces. Los
medios sólidos suelen presentarse en placas de Petri, o también en tubos, como es el caso del agar
inclinado o el medio Kliger.
Los medios de cultivo también pueden clasificarse en “medios corrientes” y “medios especiales”.
Dentro de los últimos distinguimos entre medios enriquecidos, selectivos y diferenciales. Algunos
medios reúnen, como veremos, características de dos grupos, siendo selectivos y diferenciales, o
enriquecidos y diferenciales.
• Medios corrientes o generales:
Son medios que permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos no exigentes en
cuanto a requerimientos nutricionales.
• Medios nutritivos o enriquecidos:
Se obtienen a partir de un medio común, al que se añaden elementos nutritivos adicionales como
sangre, albúmina, yema de huevo… Permiten el crecimiento de microorganismos nutricionalmente
exigentes, que no crecerían en un medio corriente, o lo harían con dificultad.
• Medios selectivos o inhibidores:
Son medios modificados para que, en una población mixta, sólo crezcan determinados
microorganismos. Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de una parte de ellos, y/o que
favorecen el crecimiento de otros.
• Medios indicadores o diferenciales:
Son medios que permiten diferenciar entre dos microorganismos según su crecimiento en ellos. Esa
diferencia en el crecimiento se debe a una diferencia metabólica entre ambos microorganismos.
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Medios de cultivo de uso habitual

• Agar MacConkey: Medio selectivo y diferencial para enterobacterias.
Es selectivo porque contiene sales biliares y cristal violeta, que impiden el crecimiento de bacterias
Gram +. Es diferencial porque nos indica si la bacteria fermenta o no lactosa, ya que incorpora
lactosa y un indicador de pH. Si lo hace, genera ácidos como producto de su metabolismo, baja el
pH del medio y el indicador cambie a rojo (el medio y las colonias adoptan un tono rosado o rojizo).
Si no lo hace, no hay cambio de color y las bacterias crecen blancas o incoloras.
• Agar manitol salado: Medio selectivo y diferencial para Staphylococcus.
Es selectivo para Staphylococcus (y Micrococcus), ya que contiene una concentración de NaCl del 7-
10%, inhibitoria para el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Es diferencial porque nos indica
si la bacteria fermenta el azúcar manitol, ya que incorpora manitol y un indicador de pH. La bacteria
patógena S. aureus fermenta manitol, produciendo un viraje del medio de rosado a amarillo; el
componente de la microbiota normal, S. epidermidis, no fermenta, manteniendo el medio sin
cambio de color.
• Agar sangre: medio enriquecido y diferencial.
Es un medio corriente al que se añade sangre para aumentar su valor nutritivo. Es también
diferencial porque no muestra si los microorganismos que son capaces de hemolizar (degradar los
glóbulos rojos de la sangre) o no. Las bacterias hemolíticas forman halos de aclaramiento en torno
a la colonia por secreción de enzimas que rompen los eritrocitos. En general se consideran tres tipos
de hemólisis, que vamos a poder observar en este medio:
Hemólisis alfa o incompleta: las colonias aparecen rodeadas de un halo verdoso, ya que el
microorganismo no rompe los glóbulos rojos, sino que transforma la hemoglobina en
metahemoglobina (verde).
Hemólisis beta o completa: las colonias aparecen
rodeadas de un halo transparente, ya que el
microorganismo produce hemolisinas que rompe los
glóbulos rojos (desaparece el color).
Hemólisis gamma, que realmente significa ausencia
de hemólisis. No hay cambio de color en torno a las
bacterias, ya que el microorganismo no es hemolítico.

• Medio Kligler (TSI): medio diferencial.

Este medio se utiliza principalmente para identificación de enterobacterias. También se llama Triple
sugar iron (TSI), ya que contiene glucosa, lactosa y sacarosa (tres azúcares), aunque la cantidad de
glucosa es 10 veces menor a la de otros azúcares. Incorpora sales de hierro y un indicador de pH,
que nos revelará si han tenido lugar fermentaciones de azúcares, ya que este tipo de metabolismo
(anaerobio) genera ácidos que cambian el color del medio. Es muy utilizado para la identificación de
enterobacterias, y en una sola prueba nos proporciona muchos datos útiles para la identificación de
este grupo de bacterias. Al preparar este medio, el agar fundido (salido del autoclave) se deja enfriar
dentro del tubo con éste en posición inclinada, de modo que se forman dos zonas dentro del tubo.
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La porción inclinada o “pico de flauta” o “slant” es esencialmente aerobia, ya que está expuesta al
oxígeno atmosférico, mientras que la porción inferior o “fondo” está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. Después de incubar el medio, la interpretación es la siguiente:
Si un microorganismo es aerobio estricto, solo podrá crecer en la parte superior del tubo; ahí
utilizará los azúcares mediante metabolismo aerobio, sin acidificar el medio, y al utilizar también
otros compuestos del medio generará productos alcalinos que harán virar la porción superior del
tubo a rojo y, con el tiempo, el color difundirá al resto del tubo, de modo que todo él estará de ese
color. Ese perfil rojo-alcalino en el slant y rojo-alcalino en fondo es indicativo de un microorganismo
aerobio estricto.
Si el microorganismo es capaz de sobrevivir sin oxígeno crecerá tanto en el slant como en el fondo:
arriba tendrá metabolismo aerobio, y abajo metabolismo fermentativo. Si es capaz de fermentar
glucosa, pero no lactosa, ocurrirá lo siguiente: durante las primera horas, consumirá la glucosa,
generando ácidos en la parte anaerobia que pueden amarillear todo el tubo (la parte superior tiene
metabolismo aerobio y se colorea de rojizo, pero el ácido puede difundir desde abajo y cambiar el
color del slant). Sin embargo, cuando se agote la glucosa, y al no poder utilizar lactosa, comenzará
a utilizar los aminoácidos mediante oxidación; eso solo sucede en la parte superior del tubo, donde
hay oxígeno, generando un cambio de color a rojo en la parte superior, mientras que el fondo sigue
amarillo. Ese perfil (rojo-alcalino en el slant, y amarillo-ácido en el fondo) es indicativo de que el
microorganismo es aerobio facultativo (crece en ambas porciones) pero no fermenta lactosa. Si el
microorganismo puede fermentar lactosa, cuando agote la glucosa seguirá fermentando y
generando ácidos. La cantidad de lactosa es tan alta que se genera una cantidad de ácido enorme,
coloreando todo el tubo (fondo y slant). El perfil amarillo-ácido en el slant y amarillo-ácido en el
fondo indica que estamos en presencia de un microorganismo aerobio facultativo capaz de
fermentar lactosa.
Algunos microorganismos producen durante su metabolismo anaerobio sulfuro de hidrógeno, que
es incoloro. Las sales de hierro que incorpora el medio reaccionan con él y producen y precipitado
negro visible. Ese precipitado negro puede llegar a oscurecer todo el fondo del tubo y tapar la
coloración amarilla, pero si hay producción de sulfuro de hidrógeno, siempre hay color amarillo en
el fondo (fermentación de
lactosa).
Otro aspecto que podemos valorar
en el medio Kliger es si el
microorganismo produce gases
durante su metabolismo. Si esto
sucede, veremos burbujas de gas
en el medio, que pueden llegar
incluso a romperlo.
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TÉCNICAS DE SIEMBRA

Siembra por agotamiento

Para obtener un cultivo axénico a partir de uno mixto, o para pasar un cultivo a una placa nueva,
usamos una técnica de siembra llamada “siembra en estría por agotamiento”. Para ello, tocamos
una colonia individual y bien aislada en un cultivo mixto
con el asa de siembra, y la depositamos en una placa
nueva haciendo estrías en zigzag con el asa, en un
sector de la placa. A continuación, quemamos el asa, la
enfriamos, tocamos la región donde hicimos las
primeras estrías y sembramos con la misma técnica
otro sector de la placa. Hacemos eso cuatro veces
(cuatro sectores de la placa). De este modo, al quemar y arrastrar desde la última estría, las bacterias
quedarán progresivamente más separadas hasta quedar aisladas y formar colonias bien separadas
unas de otras. Nota: a cada célula aislada, que después formará una colonia, se le llama “UFC” o
“Unidad formadora de colonia”.

Siembra de agar inclinado

Algunos medios sólidos se presentan en tubos, formando una superficie inclinada sobre
la que sembramos los microorganismos, en forma de zig-zag: se llaman tubos de agar
tendido.

Inoculación de medios líquidos

Consiste en tomar una colonia de una placa de agar con un asa de siembre previamente esterilizada,
y trasladarla a un tubo de medio de cultivo líquido.

Inoculación de tubo de agar inclinado tipo TSI

En algunos casos, los medios de agar inclinado presentan dos partes: el taco o fondo,
y el bisel o parte superior. También se conocen como medios de “agar semi-tendido”.
El propósito de este medio es ver cómo se comporta la bacteria cuando tiene
disponibilidad de oxígeno (para superior) y cuando no tiene acceso al mismo (parte
inferior).
Ambas partes del medio deben inocularse utilizando un asa de siembra recta. Se toma
una pequeña parte de una colonia, se inocula el fondo del tubo por picadura
(pinchando bien al centro y sin llegar a tocar el fondo) y, a continuación, se realiza una estría sobre
la parte inclinada con lo que quedó.
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Siembra en cuadrantes
Consiste en dividir una placa en cuatro partes, trazando las divisiones por
la parte posterior con un plumón. Nos permite optimizar las placas, utilizan
solo una para trabajar con cuatro microorganismos diferentes.
Esterilizamos el asa de siembra, enfriamos en una zona de la placa de
origen donde no haya cultivo, tomamos una parte de una colonia bien
aislada y estriamos la superficie del cuadrante de la nueva placa, sin salir
del espacio marcado. A continuación, quemamos el asa, tomamos la
siguiente bacteria, y repetimos el proceso en un cuadrante nuevo, y así hasta terminar de sembrar
los cuatro cuadrantes.

TIEMPO DE AUTOESTUDIO

• Observa la técnica de siembra por agotamiento en este link:

https://www.youtube.com/watch?v=6NckVGCobwY

• Observa la técnica de siembra de agar inclinado en este link:

https://www.youtube.com/watch?v=ONy_T3d25xU

Reflexionemos: La gran cantidad de medios de cultivo que existen en la actualidad, ¿permite que
todas las bacterias, sin excepción, puedan ser crecidas en laboratorio? Justifica tu respuesta.