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Objetivos:
Identificar e interpretar el crecimiento de enterobacterias en medios selectivos.
Identificar e interpretar el crecimiento de enterobacterias en las pruebas bioquímicas e
IMViC.
AGAR SANGRE
Para proceder al aislamiento es necesario tener al menos una sospecha de qué género podría ser, por
ejemplo, a diferencia de Salmonella, si se intenta aislar de materia fecal, para Escherichia coli, Klebsiella,
Enterobacter o Citrobacter, no se recomiendan caldos de enriquecimiento con tetrationato o selenito,
porque inhiben a la mayoría de cepas de dichos géneros. En tales casos se emplearán medios menos
inhibidores como Agar Mc Conkey o EMB para el aislamiento primario.
Las formas lactosa negativas, como Salmonella y Shigella, dan lugar a pequeñas colonias incoloras en
agares de desoxicolato citratado, McConkey, EMB. XLD y SS. Las colonias de microorganismos que
fermentan lactosa en agar con desoxicolato citratado (si no son inhibidas), en agar McConkey y en SS
aparecen rojas; en agar EMB se presentan de color púrpura oscuro a negro y a menudo tienen un reflejo
metálico.
AGAR EMB
AGAR XLD
Sin embargo, a pesar de la utilización de medios de cultivo hay que tener en cuenta cualquier propiedad
adicional de los diferentes géneros que permitan el aislamiento adecuado. Por ejemplo, para aumentar
el aislamiento de Yersinia enterocolitica de muestras fecales se puede utilizar el enriquecimiento en frío.
La reacción IMViC se utiliza para distinguir entre las diversas especies de enterobacterias.
Reacción de Indol:
El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
indólicos: indol, metil indol y ácido indolacético. Las diversas enzimas intracelulares involucradas se
denominan colectivamente “triptofanasa”, que designa el sistema completo de enzimas que median la
producción de indol por actividad hidrolítica sobre el sustrato triptófano.
Procedimiento: Se inocula un caldo triptófano o peptona. Incubar a 35-37°C por 24-48 h. Efectuar la
prueba mediante el agregado directo del reactivo de Kovacs (solución alcohólica de p-
dimetilaminobenzaldehído en medio ácido). Si hay producción de indol, se combina con producción de
color rojo en la capa de alcohol.
La prueba de rojo de metilo es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de pH para
determinar la concentración de H+ cuando un microorganismo fermenta la glucosa. La concentración de
H+ depende de la relación de gases (CO2 y H2), lo que a su vez es un índice de las diferentes vías
metabólicas de la glucosa exhibidas por los diversos microorganismos. Los diferentes patrones de
fermentación se deben a las variaciones en las enzimas relacionadas con el metabolismo del ácido
pirúvico en el microorganismo.
Todos los miembros de la familia son fermentadores de glucosa en el caldo MR-VP, después de 18-24 h
de incubación, la fermentación resultante produce derivados metabólicos ácidos: en consecuencia, en un
inicio todos los microorganismos entéricos, si se prueban darán una reacción RM (+). Sin embargo, luego
de una incubación requerida de 2-5 días, los RM (+) continúan con la producción de ácidos, lo que origina
un pH terminal bajo que vence el sistema de buffer fosfato y mantiene el medio ácido (pH 4,2 o menor).
Los microorganismos RM (-) metabolizan aún más los productos de fermentación iniciales por
descarboxilación para producir acetilmetilcarbinol neutro (acetoína), que produce una disminución de la
acidez en el medio y eleva el pH hacia la neutralidad (pH 6 o mayor). La validez de esta prueba depende
de la incubación lo suficientemente prolongada para permitir que ocurra la diferencia en el metabolismo
de la glucosa.
Procedimiento: Inocular medio MR-VP. Efectuar la prueba después de 48 a 96 horas, agregando V gotas
de indicador rojo de metilo. El color rojo indica resultado positivo. El color amarillo se interpreta como
negativo. Efectuar la lectura de la reacción inmediatamente después de haber agregado el reactivo.
Reacción de Voges-Proskauer:
La prueba VP se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro derivado del metabolismo de
la glucosa. La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, el principal intermediario en la glucólisis. A
partir del ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metabólicos: la producción de
acetoína es una de las vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias.
La prueba VP para la acetoína se utiliza principalmente para separar Escherichia coli de los grupos
Klebsiella-Enterobacter, aunque otros miembros de la familia pueden producir VP (+).
El medio también debe contener sales de amonio. Una bacteria que utiliza el citrato como única fuente
de carbono también utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Las ales de amonio son
degradadas a amoníaco e hidróxido de amonio, lo cual aumenta la alcalinidad
Procedimiento: Inocular agar citrato de Simmons con un inóculo pequeño. La reacción positiva está
indicada por la aparición en el medio de un color azul de Prusia, lo que demuestra que el
microorganismo puede utilizar el citrato como única fuente de carbono.
PRÁCTICA
MATERIALES:
Material biológico:
Klebsiella
Enterobacter
Proteus
Serratia
Medios de cultivo:
Agar Mc Conkey
Agar EMB
Agar SS
Agar XLD
Agar TSI
Agar LIA
Agar Citrato de Simmons
Medio MIO
Reactivos:
Reactivo de Kovacs
PROCEDIMIENTO
Para aislar enterobacterias a partir de diferentes muestras se puede utilizar medios selectivos donde se
observará la morfología, color y otras características de las colonias. Para ello se inocula un
microorganismo en cada uno de los medios de cultivo (agar McConkey, agar ENDO y agar XLD). Luego se
deja incubar a 37°C por 24 h .
Se debe trabajar con las colonias aisladas, de preferencia del agar Mac Conkey
En el agar TSI se inocula con asa de Kolle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar se hace
estrías en la parte inclinada.
En el agar LIA se inocula con asa de Kolle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 del agar y al
retirar el asa se hace estrías en la parte inclinada.
En el agar Citrato se siembra con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada.
En el medio MIO se siembra con el asa de kolle en aguja hasta los 2/3 del medio.
Se incuban todos los tubos de pruebas bioquímicas a 37°C por 18 a 24 h.
INTERPRETACIÓN
Medio MIO:
- Movilidad: Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de
siembra. Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
- Ornitina descarboxilasa: Resultado positivo: color púrpura. Resultado negativo: color
amarillo, a veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.
- Prueba de indol: Después de realizar las lecturas de movilidad y descarboxilación de ornitina,
agregar gotas del reactivo de Kovacs. Resultado positivo: color rojo. Resultado negativo: el
color del reactivo permanece incoloro-amarillento.
CUESTIONARIO
2. ¿Cuáles son las enterobacterias oportunistas que más se asocian a infecciones? Sustente con
datos estadísticos (Revise boletines epidemiológicos).