“AÑO DEL FORTALECIMIENTO DE LA SAOBERANIA NACIONAL”

INSTITUTO CIENCIAS DE LA SALUD

LABORATORIO CLINICO
TEMA : MEDIOS DIFERENCIALES

PROFESOR : Dr. Blgo. JORGE LINARES HUARSAYA

CURSO : MICROBIOLOGIA

CICLO : IV

TURNO : TARDE

INTEGRANTES :

 Chávez Chuqui, Milayde Amelia

 Ipushima Panduro, Leydi
 Vásquez Nolorve, George Jesús

PUCALLPA – PUCALLPA

2022
 DEDICATORIA
El presente trabajo se lo dedico con
mucho cariño y esfuerzo a mis hijos y
familia, quienes me han brindado su
apoyo incondicional a lo largo de esta
etapa formativa.

INTRODUCCION
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Existen medios de cultivo, llamados selectivos, que permiten el crecimiento de
determinadas bacterias e inhiben el desarrollo de otras porque poseen una
sustancia inhibidora.
Otros medios, llamados diferenciales, son usados para aislar los organismos
dentro de una mezcla, por los caracteres diferenciales que presentan. Suelen
ser medios sólidos y se basan en la capacidad de fermentación de un
determinado azúcar.
En esta práctica hemos utilizado un medio denominado agar Mac conkey. Es
un medio de color rosado que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas,
el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.
Este medio es selectivo contra Gram positivas debido al violeta cristal y a
muchas Gran negativas debido a las sales biliares (agentes tenso activos que
desorganizan muchas membranas externas).
En cambio las entero bacterias, están evolutivamente adaptadas a soportar las
sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores) y
pueden crecer en este medio.
Es también un medio diferencial que permite visualizar dos tipos de bacterias
según que puedan fermentar o no la lactosa, con producción de ácidos.
Las bacterias fermentadoras de la lactosa, excretan al medio gran cantidad de
ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias y sus alrededores
aparezcan de un color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro.
En cambio, las bacterias incapaces de fermentar la lactosa, recurren como
fuente de carbono a las peptonas a las que desaminan excretando iones NH4,
que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo
neutro vira a amarillo.

MEDIOS DIFERENCIALES

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Son empleados para detectar reacciones bioquímicas, con carácter diferencial
de grupos, géneros o especies microbianas, mediante el viraje de color del
indicador presente en el medio, demostrando algunas de sus características. 
Estos medios son el TSI, Citrato de Simmons, SIM y Caldo úrea.  

TSI (Triple Sugar Iron)

CARACTERÍSTICAS:

COLOR: Rojo ladrillo.

INHIBIDORES: No tiene.
INDICADOR: Rojo fenol.

 SUSTRATOS PRINCIPALES: Lactosa, sacarosa y glucosa.

 SUSTRATOS SECUNDARIOS: Tiosulfato sodico, peptona,
citrato férrico amoniacal y extractos.

Siembra: Punción profunda con asa y luego estrías en la parte de arriba.

En este medio se busca determinar la capacidad de la bacteria para degradar

los azucares, formación de gas y sulfuros de hidrógeno.
La fermentación aeróbica se produce en la parte de arriba del tubo y la
anaeróbica en el fondo del tubo. La presencia de gas se debe al CO2 producto
de la fermentación.

La degradación de la lactosa ocurre en la parte superior, la de la sacarosa en

la parte intermedia y de la glucosa en la parte profunda produciéndose un
viraje de rojo a amarillo.

El tiosulfato es reducido a sulfuro de hidrógenos quien reacciona con el citrato

férrico amoniacal para dar formación a sulfuro de hierro que es de color negro.

AGAR MACCONKEY

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Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

FUNDAMENTO

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el

desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que
inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. 
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las
colonias, y la precipitación de las sales biliares. 
Los microrganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: rojo púrpura

 Cuando la bacteria utiliza los carbohidratos se va producir acides, y por
eso por eso la colonia se ve de color rosado.

AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)

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Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.

FUNDAMENTO
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.
La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben
el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus spp.
 
Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido
sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.

Los pocos microrganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,

acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose
colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
 
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,
crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. 
La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro
negro debido a la formación de sulfuro de hierro. 

CARACTERISTICAS DEL MEDIO: medio preparado, rojo naranja

AGAR XLD

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Es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y
la diferenciación de patógenos entéricos gram negativos (Salmonella y
Shigella) a partir de muestras clínicas. Es adecuado en especial para el
aislamiento de la especie Shigella.

FUNDAMENTO

La degradacion de los carbohidratos presentes en el medio(xilosa,lactosa y

sacarosa) genera la produccion de acido haciendo virar el indicador(rojo fenol)
de rojo a amrillo en este medio se incorpora la xilosa por que es practicamente
fermentada por todas las enterobacterias con excepcion de los
microorganismo, pertenecientes al genero shigella.

La lisina se incluye para aumentar la diferenciacion delos microorganismos

pertenecientes al genero,salmonella, ya que sin lisina estos microorganismos
rapidamente fermentan la xilosa produciendo la acidificacion del medio y no se
pueden diferenciar de otras especies non patogenas. Como la cantidad de
este carbohidrato es limitada,una ves que estos microorganismos lo
consumen ,comienzan a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinizacion del
medio,este hecho se evidencia por que el rojo fenol nuevamente vira a un
color rojo. En el caso de los coliformes lisin posetiva, para previnir la
alcalinizacion del medio por la utilizacion de la lisina, se incorpora en el medio
un exeso de lactosa y sacarosa.

El medio tambien tiene la capacidad de detectar hidrogeno sulfurado atraves

del sistema indicador tiosulfato de sodio y citrato ferrico amonio.cuando el
microorganismo produce hidrogeno suifurado, se oooobservan colonias con el
centro negro. Los microorganismos no patogenos productores de hidrogeno
sulfurado no descarboxilan la lisina, cuando estan presentes estos micro
organismos la reaccion acida producida por la utilizacion de los carbohidratos
previenen el ennegrecimiento de colonias.

El desoxicolato de sodio es utilizado como inhibidor de los micro organismos

Gram posetivos.

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AGAR TSI (TRES AZUCARES DE HIERRO)

Medio universalmente empleado para la diferenciación de entero bacterias, en

base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de
ácido sulfhídrico. 

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y
glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el
sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe 3+ , los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio
del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El
tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con
una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

SIEMBRA
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo
sobre la superficie del medio.

INCUBACION

A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.

RESULTADOS
A: ácido
K: alcalino

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 1. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): K/A, el
microrganismo solamente fermenta la glucosa.
2. Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): A/A, el
microrganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): K/K, el microrganismo
es no fermentador de azúcares.
4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microrganismo produce gas.
5. El ennegrecimiento del medio indica que el microrganismo produce
ácido sulfhídrico.

 Los azucares del TSI lo utilizan por fermentación en anaerobiosis, con

producción de ácidos, gas y ácido sulfhídrico, valorándose de 1+ a 4+

T SI UTILIZACION DE AZUCARES

A/A 2+ - K/A 1+ - K/A – 4+

K/K - -

MEDIO SIM
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y
de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. 

Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

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FUNDAMENTO

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y

particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias
para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas
triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de
Kovac´ o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles
pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la
punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se
distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir
del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

SIEMBRA
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción
profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe
inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad
del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se
realice en línea recta.

INCUBACION

Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.

 
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac o de Erlich.

RESULTADOS

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la

línea de siembra. 
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. 
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en
todo el medio. 
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de
Kovac´ o de Erlich. 

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

LIMITACIONES
 En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la
movilidad puede ser difícil de observar.
 Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden
dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro
debido a la producción de ácido sulfhídrico.

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CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: ámbar.

Detecta la liberación del indol en un cultivo bacteriano, se debe ala degradación

del triptófano por la enzima triptofanasa y se detecta por acción del reactivo
covak o Erich

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AGAR LIA (LISINA DE HIERRO)
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en
la producción de ácido sulfhídrico.

FUNDAMENTO

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los

nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las
enzimas decasrboxilasa y desaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el
tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El
purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH
igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza
el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La
decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesaria
que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microrganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son

fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del
medio debido a la formación de sulfuro de hierro.

Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,

desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la
sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la
superficie del medio.

SIEMBRA

Por punción profunda con aguja de inoculación.

INCUBACION

En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C.

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RESULTADOS

1- Decarboxilación de la lisina:

 Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. K/K

 Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo/A

2- Desaminación de la lisina:

Pico rojizo/fondo amarillo. R/A

Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de
Morganella spp.

3-Producción de ácido sulfhídrico:

 Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el

límite del pico y fondo)

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: color violeta.

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 MEDIO UREA
Medio utilizado para diferenciar microrganismos en base a la actividad
ureásica.
Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus
spp., otras entero bacterias y estafilococos. 

FUNDAMENTO

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el

desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando
amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio
haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la
fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad
del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea,
como especies de Enterobacter o Klebsiella. 

SIEMBRA

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de

flauta. Algunos microrganismos pueden requerir mayor tiempo de
incubación.

Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.

INCUBACION: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.

RESULTADO: Ureasa (+), color rosado; Ureasa (-), sin cambio de color

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: amarillo

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La ureasa desdobla la urea en dos moléculas de amoniaco y bicarbonato,
puede ser detectado por cambio de color del medio de cultivo.

MEDIO AGAR CITRATO DE SIMONS

Medio utilizado para la diferenciación de entero bacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. 

FUNDAMENTO

En el medio de cultivo, el fosfato Mono amónico es la única fuente de nitrógeno

y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un
sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico, y el azul de bromo timol es el indicador de pH,
que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en
base a que los microrganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de
carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la
consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de

citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento
del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en
presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción
de citrato permeasa.

SIEMBRA

Por estrías

RESULTADO

 Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

 Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

LIMITACIONES

Verde-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede

variar el color del pico del al amarillo-amarronado. 
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar
la visualización Azul de un resultado positivo.

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  Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. 
 Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo
cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la
prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de
materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: verde.

MEDIO CITRATO

(-) (+)
Evalúa la utilización de citrato como única fuente de carbono y de
compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno.

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 CONCLUSION

La labor experimental que se ha llevado a cabo en esta Memoria Doctoral ha

comprendido el estudio taxonómico de 16 aislamientos bacterianos
procedentes de tres zonas antárticas: Johnson’s Dock y Chlorite Bay en la
isla de Livingston y Admiralty Bay en la isla del Rey Jorge. Como
consecuencia de este trabajo se puede concluir que: 1. Entre los
representantes del Orden Alteromonadales, Familia Alteromonadaceae,
debe destacarse el aislamiento de un representante del género
Shewanella,el NF22, que corresponde a una nueva especie, Shewanella
livingstonensis. 2. El resto de las especies de Shewanella estudiadas
corresponden a Shewanella frigidimarina (NF12 y NF24). 3. En el grupo de
bacterias Gram negativas incluido en la Clase de las γ-Proteobacterias,
Orden Pseudomonadales y Familia Moraxellaceae, se han estudiado 11
aislamientos pertenecientes al género Psychrobacter. Dos de ellos son
especies nuevas, Psychrobacter luti (NF11T)yPsychrobacter fozii (NF23T y
EN4). 4. El resto de las especies de Psychrobacter tienen un perfil
taxonómico que corresponde a Psychrobacter immobilis (NF18,NF19,NF20,
EN1 y EN2) y Psychrobacter glacincola (NF1, NF7 y NF8). 5. En el grupo de
bacterias Gram positivas estudiado (20CMT y 20CO) cabe señalar la
descripción de una nueva especie del género Paenibacillus, incluido
naturalmente en la Familia Paenibacillaceae,ClaseBacilli. Esta nueva
especie se ha denominado Paenibacillus antarcticus.

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 BIBLIOGRAFÍA

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos

Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de
Venezuela. Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo
Microbiológicos. Merck. 2002. Microbiology Manual Ortega, Y; Quevedo F.
1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A. México D.F.
Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa. Prof. Alessandra
Garcés Octubre 2001.

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