TALLER SOBRE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

1. Explica los mtodos que se utilizan para el aislamiento de microorganismos.

Mtodos para aislar bacterias

Las bacterias son esenciales para el apropiado funcionamiento de los ecosistemas. Descomponen los organismos muertos y reciclan materia orgnica transformndola en nutrientes minerales. Aislar bacterias en un cultivo puro ayuda a los investigadores a estudiar y ganar entendimiento sobre las propiedades fisiolgicas de ciertos organismos que no es posible recabar en una base de estudio ms amplia. Las diferentes bacterias prefieren diferentes condiciones fsicas y qumicas. Algunas tienen un lmite de tolerancia. Por esta razn, se utilizan varios mtodos para aislar y estudiar microbios.

Placa de diseminacin El mtodo de aislamiento por diseminacin en placa es un procedimiento en el cual el investigador disemina una mezcla diluida de clulas sobre una superficie de agar, utiliza una varilla doblada de vidrio esterilizada, de tal forma que cada clula crece en su propia colonia separada. Los cultivos son incubados por un periodo de tiempo especfico. En el medio slido aparece un crecimiento macroscpicamente visible o un grupo de microorganismos, cada colonia representando un cultivo puro. Luego de que las colonias han crecido, son contadas y se calcula el nmero de bacterias en la muestra original. Placa vertida El procedimiento de placa vertida se utiliza extensivamente con bacterias y hongos y tambin puede producir colonias aisladas. Se prepara una muestra bacteriolgica diluida. El investigadorintroduce una pequea cantidad dentro de un plato de petri vaco. Se vierte agar derretido dentro del plato de petri que contiene la muestra. El agar y la muestra se mezclan meticulosamente al cubrir el plato e inclinarlo y revolverlo suavemente. Se le da tiempo para que el agar se vuelva gel mientras se asienta sobre la superficie plana. Los platos recubiertos se invierten y se dejan incubar por un periodo de tiempo especfico. Las colonias son luego observadas y contadas, y se registra la informacin. Placa estriada El mtodo de estras en placa es el procedimiento clsico para aislar cepas de bacterias. El investigador esteriliza un lazo de alambre con una llama. Luego de enfriarse, el lazo de alambre es colocado en una placa de agar estril. El investigador sumerge el lazo dentro de la muestra, recogiendo miles de bacterias, y a continuacin realiza estras con el lazo en la superficie de agar. Luego de esterilizar nuevamente el lazo y dejar que se enfre, el investigador arrastra el lazo a travs del recorrido anterior, levantando un grupo de bacterias

y realiza otra estra en un rea diferente del agar. Este procedimiento se repite varias veces. Los platos cerrados son incubados por un periodo de tiempo especfico, luego del cual se observa el crecimiento bacteriano. Placa de exposicin La exposicin de un medio estril al ambiente demuestra la tcnica asptica. El investigador etiqueta dos placas de agar de nutrientes para una comparacin y observacin posterior y se las deja descubiertas. Se permite que una placa de agar permanezca como est, exponindola al ambiente por un corto periodo de tiempo. La segunda placa es expuesta a una fuente de posibles contaminantes, tales como un estornudo, tos o dedos colocados en contacto directo con la superficie de agar. Las placas se cubren, invierten e incuban a temperatura ambiente por un periodo de tiempo antes de la observacin.

2. Qu tipo de microorganismos se pueden aislar en los siguientes medios de cultivo. a) Agar cetrimida b) Agar Eosina azul de metileno (EMB) c) Agar Mc Conkey d) Agar Lipman libre de nitrgeno e) Agar sal manitol f) Agar Sabourau-Rosa de Bengala-Estreptomicina g) Agar Vogel Johnson

MEDIO DE CULTIVO Agar cetrimida

Agar Eosina azul de metileno (EMB)

Agar Mc Conkey

MICROORGANISMO Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del gnero. Medio utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Enterococcus spp. Acinetobacter spp Salmonella Shigella Candida Escherichia coli Citrobacter spp Este medio se utiliza para el aislamiento

de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Agar Lipman libre de nitrgeno Agar sal manitol Este medio es utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar. Agar Sabourau Rosa de bengala Para aislamiento y recuento de levaduras Estreptomicina y mohos a partir de diversas muestras. Agar Vogel Johnson Medio utilizado para la rpida deteccin de estafilococos coagulasa positivo fermentadores de manitol, a partir de alimentos y otros materiales de importancia sanitaria y clnica. 3. De cada uno de los medios anteriores, indica cul es el componente que lo hace selectivo y a que tipo de microorganismos inhibe.

MEDIO DE CULTIVO Agar cetrimida

COMPONENTES La cetrimida es un detergente catinico (compuesto de amonio cuaternario) que acta como agente inhibidor selectivo, libera el nitrgeno y el fsforo de las clulas de casi toda la flora acompaante, aunque inhibe tambin algunas especies de Pseudomonas. El cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina, piomelaninay fluorescencia de P. aeruginosa.

MICROORGANISMOS QUE INHIBE Escherichia coli Staphylococcus aureus Stenotrophomonas maltophilia

 Agar Eosina azul de metileno (EMB)

Agar Mc Conkey

La peptona de gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo microbiano. El agar es el agente solidificante Contiene colorantes de azul de bacterias gram-positivas como metileno y eosina Y, que inhiben los las bacterias gram-positivas en estreptococos fecales, cierto grado. . Los colorantes estafilococos tambin actan como indicadores levaduras, diferenciales en respuesta a la O bien favorecer su fermentacin de la lactosa o la crecimiento con formacin de sacarosa por parte de los colonias puntiformes. microorganismos. La peptona es la fuente nutritiva La lactosa es el hidrato de carbono fermentable El agar es el agente solidificante las peptonas, aportan los Proteus nutrientes necesarios para el Enterococcus faecalis desarrollo bacteriano Staphylococcus aureus la lactosa es el hidrato de carbono fermentable la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva, Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. La diferenciacin de los microorganismos entricos se logra mediante la combinacin de lactosa y el indicador de pH rojo neutro

Agar Lipman libre de nitrgeno Agar sal manitol

El extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. el manitol es el hidrato de

Escherichia coli Klebsiella pnemoniae Proteus mirabili

Agar Sabourau Rosa de bengala Estreptomicina

Agar Johnson

Vogel

carbono fermentable el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. La dextrosa es la fuente de energa para el crecimiento de microrganismos. La peptona proporciona factores de crecimiento y la fuente de nitrgeno. La presencia de rosa de bengala en la base, suprime el crecimiento de bacterias y restringe el tamao y la altura de las colonias de mohos de crecimiento rpido. Esta restriccin ayuda en el aislamiento de mohos de crecimiento lento y pueden crecer las levaduras. Con la adicin del rosa de bengala se facilita el recuento de mohos y levaduras. El cloranfenicol inhibe el crecimiento de bacterias presentes en el medio ambiente y alimentos. La triptena y el extracto de levadura, aportan los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El telurito, el cloruro de litio y la alta concentracin de glicina, son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de la flora acompaante el rojo fenol es el indicador de pH. El indicador de pH permite la

Escherichia coli Enterococcus faecalis

Escherichia coli algunas especies de microorganismos Gram positivos y negativos proteus mirabilis Enterococcus faecalis

deteccin de la fermentacin de manitol, una caracterstica diferenciadora de la mayora de cepas de Staphylococcus aureus Los estafilococos coagulasa positivo, fermentan el manitol, produciendo la acidificacin del medio y el viraje del indicador de pH al color amarillo, y tambin reducen el telurito a teluro.