ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

 La electroforesis a través de geles de agarosa o poliacrilamida se utiliza para separar, analizar,

identificar y purificar fragmentos de ADN.
 La ubicación de las bandas de ADN dentro del gel se puede determinar directamente mediante
tinción con bajas concentraciones de colorantes intercalados fluorescentes, como bromuro de etidio
o SYBR Gold.
 Los geles de poliacrilamida son más eficaces para separar pequeños fragmentos de ADN (5-500
pb). Su poder de resolución es extremadamente alto, y los fragmentos de ADN que difieren en
tamaño en tan solo 1 pb de longitud o en tan solo un 0,1% de su masa pueden separarse entre sí.
 Los geles de agarosa tienen un poder de resolución menor que los geles de poliacrilamida, pero
tienen un mayor rango de separación. Los ADN de 50 pb a varias megabases de longitud se pueden
separar en geles de agarosa de diversas concentraciones y configuraciones.
 . Los fragmentos pequeños de ADN (50 a 20 000 pb) se resuelven mejor en geles de agarosa en
una configuración horizontal en un campo eléctrico de fuerza y dirección constantes.
LA TASA DE MIGRACIÓN DEL ADN A TRAVÉS DE GELES DE AGAROSA
1. La corriente eléctrica que fluye a través del gel. Según la ley de Ohm.
2. El tamaño molecular del ADN.
4. La conformación del ADN.
5. La presencia de colorantes en el gel y tampón de electroforesis.
6. El voltaje aplicado.
7. El tipo de agarosa
8. El tampón de electroforesis. La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y
la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones (p. Ej., Si se sustituye el tampón de
electroforesis por agua en el gel o en los depósitos), la conductividad eléctrica es mínima y el ADN
migra lentamente, o no migra en absoluto. En tampones de alta fuerza iónica (p. Ej., Si se usa
erróneamente tampón de electroforesis 10 ×), la conductancia eléctrica es muy eficiente y se generan
cantidades significativas de calor, incluso cuando se aplican voltajes moderados. En el peor de los
casos, el gel se derrite y el ADN se desnaturaliza.
CLASES DE AGAROSA Y SUS PROPIEDADES
Agarosas estándar (temperatura de fusión alta)
Las agarosas estándar (temperatura de fusión alta) se fabrican a partir de dos especies de algas
marinas: Gelidio y Gracilaria.
Se han probado varios grados comerciales de agarosas que (1) muestran una fluorescencia de fondo
mínima después de la tinción con bromuro de etidio, (2) están libres de DNasa y RNasa, (3) muestran
una inhibición mínima de las endonucleasas de restricción y ligasa, y (4) generan unas modestas
cantidades de flujo electroendoosmótico.
Agarosas de baja temperatura de fusión / gelificación
Las agarosas de baja temperatura de fusión / gelificación se han modificado mediante hidroxietilación y,
por lo tanto, se funden a temperaturas más bajas que las de las agarosas estándar.
Las agarosas de baja temperatura de fusión / gelificación se utilizan principalmente para la recuperación
rápida de ADN porque la mayoría de las agarosas de este tipo se funden a temperaturas (-65 ° C) que
son significativamente más bajas que la temperatura de fusión del ADN dúplex. Esta característica
permite la purificación simple y el procesamiento enzimático (digestión / ligadura de endonucleasas de
restricción) del ADN y permite la transformación bacteriana con ácidos nucleicos directamente en el gel
refundido.
Este hallazgo se ha aprovechado para hacer agarosas que se acercan a la poliacrilamida en su poder
de resolución y, por lo tanto, son útiles para la separación de productos de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), fragmentos pequeños de ADN y ARN pequeños <1 kb. Ahora es posible resolver el
ADN hasta 4 pb y separar los ADN en el rango de 200 a 800 pb que difieren en tamaño en un 2%.
TAMPONES PARA LA ELECTROFORECIS
 Los tampones de electroforesis contienen n Tris-acetato y EDTA (pH 8.0; TAE) (también llamado
tampón E), Tris-borato (TBE) o Trisfosfato (TPE) en una concentración de -50 mMETRO (pH
7,5–7,8).
 El TAE tiene la capacidad tampón más baja de los tres y se agotará si la electroforesis se realiza
durante períodos prolongados de tiempo.
Cuando esto sucede, la parte anódica del gel se vuelve ácida y el azul de bromofenol que migra
a través del gel hacia el ánodo cambia de color de púrpura azulado a amarillo. Este cambio
comienza a pH 4,6 y se completa a pH 3,0. El agotamiento de TAE puede evitarse mediante la
sustitución
periódica del tampón durante la electroforesis o mediante la recirculación del tampón entre los
dos depósitos.
 Los fragmentos de ADN lineal bicatenario migran un 10% más rápido a través de TAE que a
través de TBE o TPE; el poder de resolución de TAE es ligeramente mejor que TBE o TPE para
ADN de alto peso molecular y peor para ADN de bajo peso molecular. Esta diferencia
probablemente explica la observación de que la electroforesis en TAE produce una mejor
resolución de fragmentos de ADN en mezclas muy complejas como el ADN de mamíferos
TAMPONES DE CARGA EN GEL
Los tampones de carga de gel se mezclan con las muestras antes de cargarlas en las ranuras del
gel. Estos tampones tienen tres propósitos:
 1. Aumentan la densidad de la muestra asegurando que el ADN se hunda uniformemente en el
pozo
2. Añaden color a la muestra, simplificando así el proceso de carga.
3. Contienen tintes que, en un campo eléctrico, se mueven hacia el ánodo a velocidades
predecibles.
ANÁLISIS DE FRAGMENTOS DE ADN
 Los ADN que se han separado por migración a través de geles de agarosa pueden detectarse
mediante tinción con tintes con baja fluorescencia intrínseca, una fuerte afinidad por el ADN y un
alto rendimiento cuántico de fluorescencia después de unirse a los ácidos nucleicos.
Cuanto mayor sea el aumento en el rendimiento cuántico, mayor será la relación señal / ruido.
Las bandas de ADN teñidas con estos tintes se visualizan iluminando el gel con luz ultravioleta.
Tinción de ADN en geles con SYBR Gold
 SYBR Gold se puede utilizar para teñir tanto ADN como ARN en geles de agarosa y
poliacrilamida neutra convencionales y en geles que contienen desnaturalizantes, como urea,
glioxal y formaldehído.
 El rendimiento cuántico del complejo SYBR Gold-DNA es mayor que el del complejo equivalente
de bromuro de etidio-DNA y la mejora de la fluorescencia es más de 1000 veces mayor.
 SYBR Gold se suministra como un concentrado de 10.000 × en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO)
y solo debe manipularse con guantes sin talco. El alto costo del tinte impide su uso para la tinción
rutinaria de geles. Sin embargo, el colorante puede ser rentable como una alternativa al uso de
ADN radiomarcados en técnicas como el polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP) y
la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE).
 Los tintes SYBR se utilizan para teñir el ADN empapando el gel, después de la separación de los
fragmentos de ADN, en una dilución de 1: 10,000 veces de la solución de tinte de reserva. El
proceso de tinción tarda -30 min (más si elgel es espeso).
Tinción de ADN en geles con SYBR Green I