Manual del Laboratorio de Genética Vs SAD2022

Ayala-Luján JL, Hernández-Barrales M, Godina-González S,

Pacheco-Tovar MG, Pacheco-Tovar DC, Reyes-López A

PRÁCTICA 5

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

EN GELES DE AGAROSA

OBJETIVO
Realizar un corrimiento electroforético del DNA aislado y purificado para evaluar cu
concentración y calidad por un método cualitativo.

INTRODUCCIÓN
El término electroforesis se usa para
describir la migración de una partícula cargada
bajo la influencia de un campo eléctrico.
La electroforesis de ácidos nucleicos
en geles de agarosa es ampliamente usada
para separar, identificar y purificar fragmentos
de DNA y RNA de diferentes especies. La
técnica tiene una alta capacidad de resolución
de fragmentos que no se pueden separar
adecuadamente por otros procedimientos. La
localización de los ácidos nucleicos dentro del
gel de agarosa puede ser determinada
directamente tiñéndose con concentraciones
bajas de colorantes intercalantes
fluorescentes, como, el bromuro de etidio.
Bandas tan pequeñas, como de 20 pg
de DNA de doble cadena, pueden detectarse
por visualización del gel con luz ultravioleta en
un transilumindaor. Si es necesario, estas
bandas de DNA se pueden recuperar del gel y
utilizar para una amplia variedad de propósitos
dentro del área de la genética.
Pequeños fragmentos de DNA de 50-
20,000 pb tienen una buena resolución
después de su corrimiento en geles de agarosa
horizontales en un campo eléctrico de
intensidad y dirección constante. Bajo estas
condiciones, la velocidad de los fragmentos de
ADN disminuye conforme aumenta su longitud
y es proporcional a la intensidad del campo
eléctrico (McDonell et el al, 1977; Fangman
1978; Calladine et al, 1991).
Los geles se comportan como un tamiz
molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma.
Cuanto mayor es el tamaño del poro del gel,
más grande es el DNA que puede ser tamizado
(Tabla I).
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Tabla I. Rango de separación de fragmentos de DNA a través composición y fuerza iónica del buffer de
de diferentes porcentajes de agarosa
electroforesis. En ausencia de iones la
Agarosa (%) Fragmentos de DNA conductividad eléctrica es mínima y el DNA migra
0.5 700 pb a 25 kb muy lentamente. Los principales buffers usados
0.8 500 pb a 15 kb para la electroforesis de DNA de doble cadena
1.0 250 pb a 12 kb
1.2 150 pb a 6 kb son el TAE, el cual contiene Tris-acetato y EDTA
1.5 80 pb a 4 kb y el TBE o también llamado Tris-borato EDTA.
La figura 1 muestra las etapas
generales para el análisis electroforético de Visualización del gel:
una muestra de DNA. El método más conveniente y comúnmente
usado para visualizar el DNA en geles de agarosa
es la tinción con bromuro de etidio (Sharp et al,
1973), que tiene un grupo planar tricíclico que se
intercala entre las bases apiladas de ADN (Figura
2).

Corrida electroforética:
Los siguientes factores determinan la
velocidad de migración del DNA hacia el ánodo
(electrodo positivo; rojo) a través de los geles
de agarosa:
• Tamaño molecular del DNA: Figura 2. Estructura química del bromuro de etidio y su
unión al DNA.
Moléculas de DNA de doble cadena migran a
través de la matriz del gel a una velocidad que
es inversamente proporcional al log10 del La proximidad del colorante a las bases del
número de pares de bases (Helling et al. 1974), DNA induce su unión por medio de enlaces de
por lo tanto, la distancia de migración del DNA tipo van der Waals, lo que, a su vez, provoca
en el gel es inversamente proporcional al Log un incremento de la fluorescencia del colorante
de su tamaño. tras su estimulación con luz Ultravioleta (UV).
Radiación UV de 254 nm es absorbida por el
• Concentración de agarosa: depende
DNA y transmitida al bromuro de etidio,
del tamaño de los fragmentos de DNA a
mientras que radiación UV entre 302 nm y 366
separar, siendo la concentración mínima 0.7%
nm es absorbida por los enlaces propios del
(fragmentos grandes de varias Kpb) y la
colorante, en ambos casos, la energía
máxima 4% (fragmentos de 50-150 pb).
absorbida por el bromuro de etidio es emitida a
• Conformación del ADN: El ADN
590 nm en la región rojo-naranja del espectro
superhelicoidal (forma I), circular relajado
visible (LePecq and Paoletti 1967).
(forma II) y linear (forma III) migran a través de
Para capturar y analizar los geles
los geles de agarosa a diferentes velocidades
teñidos con bromuro de etidio se utiliza un
(Thorne 1966, 1967).
transiluminador, equipo con una fuente de luz
• Voltaje aplicado: la velocidad de los UV acoplado a una cámara que permite
fragmentos de DNA es proporcional a la transmitir las imágenes del gel a una
intensidad del campo eléctrico. computadora, para ser visualizadas,
• Buffer de electroforesis: La movilidad almacenadas y analizadas.
electroforética del DNA es afectada por la

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MATERIAL Y REACTIVOS
• Reactivos • Equipo y consumibles
1. Buffer de carga para DNA 1. Micropipeta
2. Buffer de corrida electroforética (TAE 1X) 2. Matraz Erlenmeyer de 250 mL
3. Marcador de peso molecular (Lambda 3. Probeta de 100 y 500 mL
DNA/HindIIIMarker, 2, #SM0101; Fermentas) 4. Puntas para micropipeta
4. Bromuro de etidio 10 mg/mL 5. Parafilm
6. Balanza analítica
7. Horno de microondas o parrilla eléctrica
8. Cámara de electrophoresis horizontal (plato,
peines, cámara)
9. Fuente de poder
10. Transiluminador
11. Fotodocumentador
12. Gradilla
13. Depósito para desechos

PROCEDIMIENTO
I. Preparación del buffer de corrida electroforética
1. Elegir la solución amortiguadora apropiada (TAE o TBE) según las aplicaciones y
necesidades.
2. Preparar un volumen apropiado del buffer de electroforesis a una concentración de trabajo
(TAE 1X o TBE 0.5X) para llenar la cámara de electroforesis y preparar el gel de agarosa, a
partir de una solución concentrada (10X o 5X). Preparar 500 mL de TAE 1X a partir de una
solución stock de TAE 5X (Anexar cálculos al reporte).
II. Preparación del gel de agarosa
1. Determinar la concentración de agarosa óptima dependiendo del tamaño del fragmento de
ácido nucleico a separar.
2. Preparar la solución de agarosa al porcentaje deseado en un buffer apropiado. En nuestro
caso se preparará un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X (100 mL).
3. Calentar en un horno microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente. Cuando la
agarosa se disuelva completamente la solución se tornará clara.
4. Dejar enfriar la agarosa a temperatura ambiente hasta aproximadamente 50 ºC.
5. Agregar 3 µL de bromuro de etidio 10 mg/mL y homogenizar.
6. Vaciar la solución de agarosa en el plato hasta formar un gel de aproximadamente 0.5 cm de
espesor, evitando la formación de burbujas. Si se forman burbujas, se pueden remover
usando una punta.
7. Colocar el peine sobre la solución de agarosa para formar los pozos.
8. Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente. El gel sólido o polimerizado tiene una
apariencia opaca. Para que el gel quede de un espesor uniforme, el plato debe estar en una
superficie plana que esté nivelada. No recargarse en la mesa durante su preparación y evitar
corrientes de aire.
9. Llenar la cámara de electroforesis con el buffer de corrimiento (TAE 1X).
10. Una vez polimerizado, colocar el gel de agarosa en la cámara.
11. Retirar el peine para dejar los pozos libres.

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III. Carga de muestra:

12. Para colocar las muestras dentro de los pozos del gel, el buffer de carga se mezcla con la
muestra antes de cargarlos en un fragmento de papel parafilm. Este buffer tiene tres
propósitos:
a. Incrementa la densidad de la muestra con la adición de glicerol, asegurándose de
que el DNA caiga uniformemente en el fondo del pozo del gel.
b. Agrega color a la muestra lo que simplifica el proceso de carga.
c. Contiene colorantes (azul de bromofenol y xilencianol) que en un campo eléctrico se
mueven hacia el ánodo a velocidades predecibles.
13. En el primer pozo del gel incluir un marcador de peso molecular para verificar el tamaño de
los fragmentos separados (Lambda DNA/HindIII).
Corrida electroforética
14. Aplicar un voltaje apropiado durante un tiempo determinado para separar el fragmento
deseado. En nuestro caso 10 minutos a 100 volts y posteriormente 30 minutos a 150 volts.
Visualización del gel
15. Verificar la presencia, cantidad y calidad de los ácidos nucleicos separados a través del uso
de un transiluminador de luz UV y guardar el registro de la imagen con un fotodocumentador
o la captura de imagen con dispositivo externo (cámara).

PRE-REPORTE
1. Defina el término electroforesis, campo eléctrico, marcador de peso molecular y
transiluminador.
2. Investigue la composición y forma de preparación del buffer de electroforesis TAE 1X.
3. Investigue a que tamaño corresponden las bandas del marcador de peso molecular Lambda
DNA/HindIII marker y anexe una imagen.
4. Realice los cálculos para preparar 30 mL de agarosa al 1% en buffer TAE 1X
5. ¿Cuál es la interpretación de observar la ausencia de bandas o bandas borrosas y extendidas
en una electroforesis de ADN?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS

Ángel-Herráez JL. Preparación de muestras, extracción y separación de ácidos nucleicos. En: Texto
ilustrado de Biología molecular e Ingeniería Genética.Conceptos, técnicas y aplicaciones en
ciencias dela salud. Primera Edición. 2000. Editorial Elsevier Science. Madrod, España. pp
117, 136.

Anaya JM, Shoenfeld Y, Correa PA, García Carrasco M, Cevera R. Autoinmunidad y enfermedad
autoinmune. Primera Edición. 2005. Editorial Corporación para investigaciones biológicas.
Medellín, Colombia. pp 504.

A. Allison L. Fundamental Molecular Biology. Primera Edición. 2007. Editorial Blacwell. Malden, MA,
USA. pp 218-219.