Las enzimas de restriccin

Puntos ms importantes:
Las enzimas de restriccin son enzimas que cortan ADN. Cada enzima
reconoce una o un nmero pequeo de secuencias blanco y corta el ADN en o
cerca de esas secuencias.

Muchas enzimas de restriccin hacen cortes escalonados que producen extremos

sobresalientes de ADN de cadena sencilla. Sin embargo, algunos producen
extremos romos.

La ADN ligasa es una enzima que une ADN. Si dos fragmentos de ADN tienen
extremos complementarios, la ligasa puede unirlos para formar una molcula
nica e intacta de ADN.

En la clonacin de ADN, se utilizan enzimas de restriccin y ADN ligasa para

insertar genes y otros fragmentos de ADN en plsmidos.

Cmo se corta y pega el ADN?

En la clonacin de ADN , los investigadores hacen muchas copias de un
fragmento de ADN especfico, como un gen. En muchos casos, la clonacin
consiste en introducir el gen en un fragmento de ADN circular
llamado plsmido que puede copiarse en bacterias.

Cmo se pueden unir fragmentos de ADN de diferentes fuentes (como un gen

humano y un plsmido bacteriano) para hacer una sola molcula de ADN? Un
mtodo comn utiliza enzimas de restriccin y ADN ligasa.

Una enzima de restriccin es una enzima que corta ADN y que reconoce sitios
especficos en l. Muchas enzimas de restriccin hacen cortes escalonados en o
 cerca de su sitio de reconocimiento y producen extremos sobresalientes de
cadena sencilla.

Si dos molculas de ADN tienen extremos complementarios, la enzima ADN

ligasa puede unirlos. La ADN ligasa sella el espacio entre las molculas para
formar un solo fragmento de ADN.

Las enzimas de restriccin y la ADN ligasa se suelen usar para insertar genes y
otros fragmentos de ADN en plsmidos durante la clonacin de ADN.

Enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin se encuentran en bacterias (y otros procariontes).
Reconocen secuencias especficas de ADN, llamadas sitios de restriccin, y se
unen a ellas. Cada enzima de restriccin reconoce solo uno o unos pocos sitios de
restriccin. Cuando encuentra su secuencia blanco, la enzima de restriccin
cortar las dos cadenas de una molcula de ADN. Por lo general, el corte es en o
cerca del sitio de restriccin y ocurre en un patrn ordenado y predecible.
Como un ejemplo de cmo una enzima de restriccin reconoce y corta en una
secuencia de ADN, veamos a EcoRI, una enzima de restriccin de uso comn en
el laboratorio. EcoRI corta en el siguiente sitio:

5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'

Sitio de EcoRI

Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrn muy
especfico que produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:
 Una enzima EcoRI se une a un sitio EcoRI en un fragmento de ADN y hace
cortes en ambas cadenas del ADN. El patrn de corte es:

5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'

De esta manera se produce un extremo de 5'-AATT-3' que sobresale en cada

extremo del ADN cortado.

Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias

(porque tambin se cort con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse
por complementariedad de bases. Por esta razn se dice que las enzimas que
dejan extremos de cadena sencilla producen extremos cohesivos. Los extremos
cohesivos son tiles en la clonacin porque mantienen dos fragmentos de ADN
juntos para que la ADN ligasa los pueda unir.

No todas las enzimas de restriccin producen extremos cohesivos. Algunas

producen "extremos romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no
dejan extremos de cadena sencilla. La enzima de restriccin SmaI es un ejemplo
de enzima que corta as:

La enzima SmaI se une aI sitio de restriccin de SmaI , que es:

5'-...CCCGGG...-3' 3'-...GGGCCC...5'
 La enzima corta en medio de esta secuencia en ambas cadenas y produce
extremos romos. Los sitios de corte son:

5'-...CCC|GGG...-3' 3'-...GGG|CCC...5'

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre s. Sin embargo, es ms difcil
ligar fragmentos romos (la reaccin de ligacin es menos eficiente y es ms
probable que falle) porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla
que sostengan a las molculas de ADN en su posicin.

En la digestin con enzimas de restriccin y la

ligacin participan muchas molculas de ADN
En el ejemplo anterior, vimos un resultado de la ligacin entre un gen y un
plsmido con EcoRI. Sin embargo, en esta misma reaccin de ligacin podran
ocurrir otros resultados. Por ejemplo, el plsmido cortado podra recircularizarse
(cerrarse en su estado original) sin incorporar el gen. Asimismo, el gen podra
entrar al plsmido, pero en direccin contraria (puesto que sus dos extremos
cohesivos de EcoRI son idnticos).

Izquierda: plsmido recombinante producido cuando el gen entra en sentido hacia

adelante ("apuntando" en la direccin del promotor que se encuentra en el
plsmido).

Centro: plsmido no recombinante que se produce cuando el plsmido cortado

simplemente se vuelve a cerrar (sus extremos se ligan entre s).
 Derecha: plsmido recombinante producido cuando el gen entra en sentido
inverso ("apuntando" en direccin contraria al promotor que se encuentra en el
plsmido).

La digestin con enzimas de restriccin y la ligacin como esta se realiza con

muchas copias de ADN del plsmido y del gen. De hecho, en una sola ligacin se
utilizan miles de millones de molculas de ADN! Todas estas molculas estn
chocando entre s y con la ADN ligasa al azar y de diferentes maneras. Por lo
tanto, si es posible formar varios productos, todos se producirn con cierta
frecuencia, incluyendo los que no queremos.

Cmo podemos evitar plsmidos "malos"? Cuando transformamos bacterias con

el ADN de una ligacin, cada una toma un fragmento diferente de ADN. Despus
de la transformacin, podemos revisar las bacterias y usar solo aquellas que
tengan el plsmido correcto. En muchos casos, el plsmido de las bacterias
transformadas se analiza mediante otra digestin con enzimas de restriccin para
ver si contienen el inserto correcto en la orientacin correcta.