Protocolo azúcares solubles, AIR, almidón y hemicelulosas

Alicia Perera, 14/07/2021

1) Extracción del AIR (alcohol-insoluble residual)

- Añadir 625 µl de etanol al 80% a 20-50 mg de material vegetal seco (liofilizado o en estufa) y molido. Usar
tubos de 2 ml pesados antes y después de introducir el material vegetal  peso tubo (WT) y peso tubo +
muestra seca (WTS).
- Calentar a 70ºC en agitación durante 1-2 h.
- Centrifugar a 13000 g 10 min y separar el sobrenadante en un tubo aparte de 2 ml.
- Volver a lavar el pellet con otros 625 µl de etanol al 80% y repetir los dos pasos anteriores. Juntar el
sobrenadante (en total 1.25 ml de extracto). Reservar el sobrenadante para la cuantificación de azúcares
totales solubles (paso 2).
- Lavar el pellet con acetona a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras se agita con la mano al
menos dos veces.
- Centrifugar a 13000 g 10 min. Desechar el sobrenadante y dejar secar bien el pellet (debe parecer arenilla y no
agregarse). Para secarlo bien, se puede o bien abrir el tubo bajo campana durante dos días para que se
evapore toda la acetona o ponerlo en un calentador a 60ºC también en estufa durante toda la noche.
- Pesar de nuevo el tubo con el pellet completamente seco (WTAIR) y restarlo al tubo con la muestra seca para
obtener el AIR (porcentaje de la fracción insoluble en alcohol respecto al peso seco). Reservar el pellet para la
cuantificación de almidón y hemicelulosas (paso 3 y 4).

W TAIR −W T
AIR ( % )=100·
W TS−W T

2) Cuantificación de azúcares totales solubles 3) Cuantificación de almidón (con el AIR)

(con el sobrenadante de etanol 80%)
- Añadir 0.8 ml de agua destilada al pellet seco.
- Preparar una curva patrón de glucosa en - Tras el agua, añadir 0.8 ml de ácido perclórico al
etanol de 0.05 a 0.3 mg/ml en tubos de 15 70%, agitar y mantener en la nevera con placas
ml que servirán de stock. de hielo durante 30 min.
- Pipetear 250 µl de la extracción alcohólica - Centrifugar la muestra 13000 g 10 min.
(dilución 1/100) o de la curva patrón en un Transferir el sobrenadante a un matraz aforado
nuevo tubo de vidrio que pueda cerrarse de 25 ml. Reservar el pellet para hemicelulosas
bien con tapa, nunca llenando el tubo más (paso 4).
de dos tercios. También sirve un tubo - Repetir los tres pasos anteriores. Tras
eppendorf de 2 ml, siempre y cuando todos centrifugar, unir el sobrenadante al obtenido
los tubos se analicen igual, incluida la curva anteriormente y enrasar el matraz a 25 ml.
patrón. 01 - Mezclar en un bote de vidrio con tapa de rosca
- Mezclar con 250 µl de fenol al 5% (w/v). 0.1 ml de la muestra del matraz + 2.5 ml del
OJO! El fenol es tóxico! Usar siempre guantes reactivo antrona y mantener a 90-100ºC
de protección, bata SIN REMANGAR y la durante 10 min, agitando de vez en cuando.
campana de extracción con el cristal bajado! Incluir los botes adicionales para la curva
- Añadir lentamente 1.25 ml de ácido sulfúrico patrón.
(la muestra se calentará un poco y puede - Tras los 10 min, enfriar las muestras 3 min en
burbujear y echar humillo), cerrar bien el nevera y medir la absorbancia a 620 nm.
Ingredientes
tubo para ela reactivo
y mantener antronaambiente
temperatura (caduca a
los cuatro días de su elaboración):
durante 20 min, agitando cuidadosamente
de vez - en200cuando.
mg deNO VOLTEAR.
anthrone puroPipetear
(ojo, el
con la pipeta automática
disponible de 5está
en el almacén mla 97%).
nunca
directamente
- delácido
100 ml bote.sulfúrico
Pipetear lentamente,
95%
nunca dejar que entre sulfúrico dentro de la
pipeta!
- Leer la absorbancia a 490 nm.
 4) Cuantificación de hemicelulosas

- Añadir al pellet resultante de la cuantificación de almidón 500 µl de agua. Agitar y centrifugar a 13000 g 10
min.
- Añadir 500 µl de acetona, agitar y centrifugar a 13000 g 10 min.
- Dejar secar el pellet bien tal y como se hizo para la obtención del AIR. Cuando el pellet esté seco (como
arenilla), se vuelve a pesar el tubo (W T-Starch). El porcentaje de starch en el AIR se calcula a partir de los pesos:

W T −Starch−W T
Starch (%AIR )=
W TAIR −W T
- Pesar en otro bote (o tubo eppendorf o falcon) 3 mg de pellet resultante.
- Hidrolizar con 800 µl de ácido tricloroacético 2 N y esperar 30 min a que se hidrate bien, volteando de vez en
cuando antes de ponerlo a 121ºC durante 1 h (cuidado, puede estallar el tubo! Poner un peso a las tapas).
- Centrifugar a 13000 g 10 min. Sobrenadante  hemicelulosas; Pellet celulosas y lignina
- Cuantificar azúcares solubles (hemicelulosas solubilizadas) como en el punto 2).
- Lavar con agua y con acetona dos veces cada una.
- Secar a temperatura ambiente en campana de extracción hasta que sea móvil como la arenilla (24 h).
- Resuspender en 200 µl de ácido sulfúrico al 72% (v/v) a temperatura ambiente durante 1 h.
- Diluir con agua hasta 0.8 M de ácido sulfúrico. Para ello se añaden 5.8 ml de agua.
- Hidrolizar a 121ºC durante 1 o 2 h.
- Dejar enfriar y cuantificar azúcares solubles como en el punto 2).

Referencias:
Azúcares solubles  Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.T. and Smith, F., 1956. Colorimetric method
for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry, 28(3), pp.350-356.

Almidón  Hodge, J.E and B.T. Hofreiter. 1962. In: Methods in Carbohydrate Chemistry (eds. Whistler, R.L and
BeMiller, J.N.), Academic Press, New York.

Hemicelulosas  Schädel, C., Blöchl, A., Richter, A. and Hoch, G., 2010. Quantification and monosaccharide
composition of hemicelluloses from different plant functional types. Plant physiology and Biochemistry, 48(1), pp.1-8.