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Amplificación de Plásmidos

A) Transformación:

1) Esterilizar el material.
- Tips amarillos, azules y 0.1
- Probeta de 100 ml
- Tubos
- Erlenmeyer
- Eppendorf

2) Preparar medio LB (20 g/l) y autoclavar.

3) Tener bacterias competentes.

4) Preparar placas LB-ATB. Se usa el ATB al cual la bacteria adquiere la resistencia al incorporar
el plásmido.
Placas: 3g agar/200 ml de LB. Autoclavar y una vez que termina esperar que llegue a
temperatura sin que solidifique el agar (aproximadamente cuando uno puede tocar el frasco). En
ese momento agregar el ATB que corresponda.

Solución Stock Concentración de trabajo


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Concentración Almacenamiento Plásmido Plásmido relajado
astringente

Ampicilina 50 mg/ml H2O -20ºC 20 µg/ml 60 µg/ml


Carbenicilina 50 mg/ml H2O -20ºC 20 µg/ml 60 µg/ml
Cloranfenicol 34 mg/ml EtOH -20ºC 25 µg/ml 170 µg/ml
Kanamycina 10 mg/ml H2O -20ºC 10 µg/ml 50 µg/ml
Streptomycina 10 mg/ml H2O -20ºC 10 µg/ml 50 µg/ml
Tetraciclina 5 mg/ml EtOH -20ºC 10 µg/ml 50 µg/ml

La soluciones stock de ATB disueltas en H2O deben ser esterilizadas por filtración a través de un
filtro de 0.22µ. Los ATB disueltos en EtOH no necesitan ser esterilizados.
Los iones Mg2+ son antagonistas de las tetraciclinas. Usar medio sin sales (ej: medio LB) para la
selección de bacterias resistentes a tetraciclinas.
Esperar a que el agar solidifique y guardar en la heladera hasta el momento de plaquear

5) Transformación de bacterias.

- 100 µl bacterias competentes + 1 µl Plásmido (200 ng/ml). Para transformar el volumen


del plásmido no puede ser mayor que el volumen de bacterias (que no supere el 10% del
volumen).

- Incubar 30 min. a 4ºC (hielo).

- Incubar 1 min. a 42ºC.

- Incubar 2 min. a 4ºC (hielo).


- Agregar 300 µl LB sin ATB.

- Incubar 1h 37ºC agitándose.

- Plaquear 50 µl.

B) Minipreps ClLi para plásmidos:

1) De cada placa de bacterias que han sido transformadas se pican 3-4 colonias para realizar un
cultivo en 3ml de LB-ATB, ON a 37ºC.

2) Del cultivo realizado se toman aproximadamente 1.5 ml y se centrifuga 2 min 10000 xg.

3) Buffer TELT

50 ml 10 ml
Tris/HCl 1M pH: 7.5 2.5 ml 0.5 ml
EDTA 250 mM 12.5 ml 1.5 ml
Triton X-100 0.2 ml 40 µl
ClLi 5.3 g 1.1 g

Composición final del buffer: - Tris/ClH pH: 7.5 50 mM


- EDTA 62.5 mM
- Triton X-100 0.4%
- ClLi 2.5 M

4) Preparar la mezcla Telt-Lisozima.


90 µl de Telt + 10 µl de Lisozima (10 mg/ml). Se utiliza de la mezcla 100 µl por tubo. Se agrega
la mezcla a las bacterias, luego se vortexea bien de manera que queden todas las bacterias
bien resuspendidas.

5) Se deja 5 min. a temperatura ambiente.

6) Hervir 1 min. ( agujerear la tapa del eppendorf antes de hervir)

7) Dejar en hielo 2 min.

8) Centrifugar entre 10-20 min. 10000xg.

9) Recoger el sobrenadante.

10) Agregar 1 volumen de isopropanol, dejar 20 min. a temperatura ambiente.

11) Centrifugar 20 min., descartar el sobrenadante.

12) Lavar el pellet con 100 µl de EtOH 70%.

13) Centrifugar 5 min. 10000xg.

14) Secar en bomba de vacío.


15) Resuspender en 10 µl de agua estéril (se usan 5 µl para la digestión enzimática).

16) Conservar a –20ºC hasta el momento de realizar el gel.

C) Gel Agarosa 1% - Bromuro de etidio:

Gel
1) Se prepara 50 ml: - 0.5 g Agarosa.
- 50 ml de TBE 0.5 x.

2) Calentar hasta que la solución este transparente.

3) Dejar enfriar, hasta que se pueda tocar.

4) Agregar 4 µl de Bromuro de etidio.

6) Armar el gel.

7) Correr con 300 ml de TBE 0.5 x.

Muestras

5µl de la muestra + 2µl buffer loading + 3µl de agua.


Se siembra la totalidad.

20 µl de muestra digerida + 4 µl buffer loading 6x.


Se siembra la totalidad.

Standar λDNA/HindIII Markers.


10 µl λDNA/HindIII.
16.7 µl buffer loading.
23.3 µl Agua.
Se siembra 1-3 µl.

D) Midiprep:

1) El día anterior se realizan precultivos de las colonias elegidas por los resultados del gel.
4ml LB + ATB + 20µl de bacterias de la mini. Incubar ON 37ºC.

2) Batch para miniprep:


80 ml LB + ATB + 4 ml de bacterias en erlenmeyer esterilizado. Incubar a 37ºC ON.

3) Obtención del lisado bacteriano:

- Pelletear las bacterias a 10000 xg 10 min a 4°C (tubos gordos Sorvall). Se hace en dos
veces, o sea se pelletea, se elimina el sobrenadante, cargar el resto y pelletear.

- Eliminar el sobrenadante y secar el tubo sobre papel.


- Resuspender completamente el pellet en 3 ml de solución de Suspensión. (vortexear
bien).

- Agregar 3 ml de Solución de lisis. Mezclar por inversión 4 veces. La solución se aclara.


(Algunas bacterias son más resistentes a la lisis y requieren una incubación de 3-5 min.
para una lisis eficiente. Lo mismo ocurre con cultivos de más de 50 ml. ∆ No extender la
lisis por más de 3-5 min. porque el ADN puede pasar a simple cadena.

- Agregar 3 ml. de Solución de neutralización. Mezclar por inversión 4 veces.

- Centrifugar el lisado a 14000 xg por 15 min. a 4ºC. Si al final de la centrifugación no se


obtiene un pellet bien firme, centrifugar 15 min. más.

- Pasar el sobrenadante a otro tubo evitando tocar el precipitado.

4) Purificación del Plásmido.

- Disolver los agregados de la Resina, si es necesario, calentando a 25-37ºC 10 min.


Enfriar a 30ºC antes de usar. Agitar antes de cargar ya que es una suspensión.

- Mezclar el sobrenadante anterior con 10 ml de Resina. ∆ No se requiere una


incubación muy excesiva del Plásmido con la resina porque a esa concentración el
Plásmido se pega a la resina inmediatamente. ∆ No dejar la resina en contacto con el
lisado más del tiempo que se requiere para cargar las minicolumnas.

- Colocar la columnita en un kitasato con tapón de goma. Si no queda bien justo sellar
con parafilm. Aplicar vacío. Bomba De Vació: abrir canilla, encender interruptor,
conectar manguera. Para sacar el vacío es al revés.

- Una vez que pasó toda la resina se realizan 2 lavados con 15 ml de Solución de lavado
cada uno. No permitir que la columnita se seque.

- Secar la Columnita 30 seg. No superar ese tiempo.

- Cortar la columnita con un cutter y colocarla en un eppendorf.

- Centrifugar 2 min. a 10000 xg para extraer los restos de solución de lavado.

- Pasar la columnita a otro eppendorf estéril. Agregarle 300 µl de agua destilada estéril y
centrifugar 20 seg. para eluir el plásmido.

- Centrifugar el eppendorf 5 min. a 10000 xg para pelletear las partículas de resina que
queden en suspensión y pasar el sobrenadante a otro eppendorf estéril.

- Se puede lavar con 50-100 µl de agua destilada estéril si al cuantificar la cantidad de


ADN es poca. Tener en cuenta que el Plásmido se conserva bien en la columnita hasta
30 min., al cabo de los cuales existe riesgo de que se nickee.

- Conservar a 4ºC o –20ºC.


D) Cuantificación:

1) Gel de Agarosa grande para cuantificar.

- Buffer TBE 1x. Se usan 250 ml que se reparten, 210 ml para buffer de corrida y 40 ml
para hacer el gel.

- Para un gel 1% poner 0.4 g de agarosa en 40 ml de TBE 1x.

- Calentar hasta que la solución este transparente. Dejar enfriar.

- Agregar 1µl de Bromuro de Etidio a los 40 ml de TBE 1x con agarosa. Agitar


suavemente y volcar en la cubeta a la que se le coloca el peine. Es importante que no
se formen burbujas.

- Agregar 5µl de Bromuro de Etidio a los 210 ml restantes de TBE 1x y está listo para
usar como buffer de corrida.

2) Muestra

Plásmido sin digerir.


Dilución 1/10: 1µl de ADN + 10µl de agua.
De la dilución se toman alícuotas de 3 y 5 µl, se le agrega 5 µl de buffer loading BPG y se lleva
a 10µl de volumen final con agua.
∆ Se siembra la totalidad de la muestra.

E) Digestión enzimática:

Cualitativo:
5µl ADN + 1µl ARNasa + 10µl agua + 2µl EZ + 2µl buffer.
2h a 37ºC.(volumen final 20µl)
Todo lo digerido 20µl se le agrega 4µl de buffer loading y se siembra la totalidad o lo que se
pueda según lo que permita la calle.

Cuantitativo:
1µl ADN + 1µl EZ + 1µl ARNasa + 2µl buffer + 15µl agua.
2h a 37ºC. (Volumen final 20µl)
Se toman alícuotas de 1,3 y 5µl del digerido, se agrega 5µl de buffer loading BPG y se lleva a
10µl con agua. (Volumen final 10µl).

F) Glicerol Stock:

- 40µl del cultivo (mini) + 4 ml LB + ATB Crecer ON 37ºC.

- 850µl del cultivo ON + 150µl de glicerol estéril. Vortexear y guardar a –70ºC.