Trabajo Práctico N°2: Determinación de Fibras Totales

Técnica Enzimático-Gravimétrica
Método OFICIAL 991.43
Enzimología (835)
Introducción
La fibra dietética está constituida por polisacáridos no amiláceos, y se subdivide
en soluble e insoluble. En el salvado predominan la celulosa y la hemicelulosa
lignificadas y poco solubles; mientras que en las paredes celulares están las pentosanas
(arabinoxilanas), los frutanos y glucanos, que son más solubles, forman geles viscosos
durante el proceso digestivo y están implicados en la calidad panificable de la harina de
centeno (Stear, 1990).

Las propiedades funcionales tecnológicas que presenta la fibra dietética como la

capacidad de retención de agua y aceite, tienen efectos benéficos en los productos
alimenticios mejorando sus características organolépticas.

El centeno contiene tanto fibra soluble como insoluble, siendo arabinoxilano, el

principal componente parcialmente soluble. En la fabricación de pan, los polisacáridos de
la pared celular en centeno tienen un profundo efecto sobre las propiedades reológicas de
la masa y el pan.

Se estima que una ingesta de 25 a 35 g diarios de fibra dietética en los jóvenes y

adultos normales contribuye a la prevención de enfermedades crónicas (FAO).

Consideraciones Generales del Método

Los ensayos se realizarán con granos de centeno obtenidos en el Instituto Nacional
de Tecnología Agropecuaria, INTA, Partido de Púan, Provincia de Buenos Aires. Las
muestras obtenidas son representativas del total de la parcela. Se seleccionaron y
clasificaron granos homogéneos y libres de daños superficiales.
El procedimiento aplicado para la determinación de Fibra Dietaria Total (FDT),
está basado en el método enzimático-gravimétrico AOAC Método Oficial 991.43 Fibra
Dietaria Total, Soluble e Insoluble en Alimentos.
Los métodos enzimáticos gravimétricos se basan en digerir las proteínas e hidratos
de carbono con enzimas, el remanente se adjudica a la FDT previo descuento del
contenido de cenizas y proteínas remanentes.
Procedimiento
La muestra seca de alimentos (2 g, por duplicado) se somete a digestión
enzimática con α-amilasa termoestable, proteasa y amiloglucosidasa.
Se emplearán tres enzimas comerciales:
α- amilasa termoestable (Bacillus licheniformis)
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 El almidón está formado por dos moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos
polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas
por enlaces α-1,4, mientras que la amilopectina tiene además uniones α -1,6 y por esta
razón forma cadenas ramificadas. La α-amilasa rompe uniones α 1,4 -tanto en amilasa
como en amilopectina-, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como
productos.
Proteasa purificada (Bacillus licheniformis)
Un enlace peptídico es la unión entre el grupo ácido de un aminoácido con el
grupo amino de otro, con la consecuente eliminación de una molécula de agua. Las
proteasas catalizan la degradación de proteínas hidrolizando los enlaces peptídicos con
diferentes grados de intensidad y de selectividad.
Amiloglucosidasa (Aspergillus niger)
Esta enzima que actúa sobre el almidón gelatinizado, libera de forma secuencial
unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores de las moléculas de amilosa y
amilopectina, actuando sobre los enlaces α-1,4 y α-1,6. En consecuencia es capaz de
hidrolizar el almidón por completo para dar moléculas de glucosa, pero se usa en general
en almidón que ha sido previamente despolimerizado con α-amilasa para generar
pequeños fragmentos y más extremos no reductores (Fennema y Tannenbaum, 2000).

Objetivos

Objetivo General
 Aplicar un método enzimático gravimétrico para la determinación de fibra total
en harina integral de Centeno producido en Argentina.
Objetivos Específicos
 Conocer el contenido de fibras total en dos variedades de centeno.
 Comparar en contenido de fibras en las variedades.

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Metodología
1) Pesar 2,000 g de muestra.

2) Agregar 80 mL de solución buffer MES – TRIS pH 8,2 a cada recipiente.

3) Incubación con α- amilasa termoestable: Adicionar 200 µL de solución α-

amilasa estable al calor con micropipeta automática, agitando lentamente.
Cubrir los recipientes con papel de aluminio e incubar en un baño
termostatizado a 95ºC - 100ºC durante 15 minutos con agitación continua.

4) Retirar los recipientes del baño y enfriar a 60º, removiendo el papel de

aluminio. Raspar dentro del recipiente para dispersar cualquier gel que se
hubiese formado en el fondo del recipiente con espátula. Enjuagar las paredes
del recipiente con 20 mL de agua con la espátula.

5) Incubación con proteasa: Añadir 400 µL de solución proteasa con

micropipeta automática. Cubrir con papel de aluminio e incubar 30 minutos a
60ºC ± 1ºC con agitación continua.

6) Remover el papel de aluminio y dispensar 20 mL de HCl 0,561 M en los

recipientes con agitación continua. Ajustar el pH a 4-4,7 a 60ºC por adición
de solución 0,1 N de NaOH o solución 1 N de HCl.

7) Incubación con amiloglucosidasa: Agregar 600 µL de solución

amiloglucosidasa con micropipeta automática. Agitar, cubrir con papel de
aluminio e incubar 30 minutos a 60º ± 1ºC con agitación constante.

8) Precipitación de fibra dietética con etanol: Para cada muestra digerida y

blancos añadir 450 mL de etanol 95% a 60ºC (proporción 4:1), medidos antes
del calentamiento. Remover del baño y cubrir los recipientes con papel de
aluminio. Dejar precipitar durante 1 hora a temperatura ambiente.

9) Filtración: Se utilizarán filtros de vidrio sinterizado, con 60 mL de capacidad

y tamaño del poro 40-60 nm. Pesar los filtros y se registrar. Adicionar 0.03 g
de agente filtrante, Celite, redistribuir con 15 mL de etanol 78% y aplicar
succión para drenar.

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 10) Filtrar el precipitado de la digestión enzimática a través del filtro con Celite.
utilizando una bomba de vacío.

11) Lavar dos veces el residuo con 30 mL de etanol 78%, dos veces con 30 mL de
etanol 95%, dos veces con 30 mL de acetona.

12) Secar el filtro conteniendo el residuo durante 8 hs. en estufa a 105ºC.

13) Enfriar los filtros en el desecador durante una hora y pesar. Calcular el peso
del residuo sustrayendo el peso del filtro y del Celite. Se utilizará uno de los
duplicados para la determinación de proteínas y el restante para determinar
cenizas.

Determinación del contenido de cenizas: Método cenizas totales (calcinación)

(KIRK, Sawyer y Egan, 1996).

1) Colocar a peso constante un crisol dos horas en la mufla a 600°C.

2) Pesar el crisol vacío y registrar peso.
3) Pesar muestra en el crisol previamente pesado.
4) Calcinar la muestra, primero con un mechero en campana hasta que no se observe
desprendimiento de humos.
5) Introducir en mufla durante 5 hs. a 540°C.
6) Enfriar en desecador y pesar.
7) Calcular el porcentaje de cenizas.

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Esquema de Trabajo

Muestra (2 g) por duplicado

80 mL de solución buffer. pH 8.2 a 24ºC

(MES/TRIS, 0.005 M cada uno)

Revolver los recipientes con las muestras con agitación para la

dispersión uniforme de la muestra

Añadir 200 µl de solución de α-amilasa en un baño de agua a 95-

100ºC, 30 min

Enfriar a 60 ° C
Raspar las paredes del vaso con una espátula y enjuagar con 20 ml de
agua + 400 µl solución de proteasa a 60ºC, 30 min de incubación

Añadir 10 ml de HCl 0,561 N a pH 4,5 (4,0 -4,7) + solución de 600

µL amiloglucosidasa a 60ºC, 30 min de incubación

Precipitar con 450 ml de EtOH al 95% precalentado a 60ºC

Filtrar y Lavar

Secar durante 8 hs en estufa a 100°C

2 residuos

Proteínas Cenizas
Fibra Dietaria Total
(FDT)