OCRATOXINAS PAPRIKA EN POLVO

PROCROCEDIMIENTO TECNICA DE PURIFICACION CON EL USO DE LAS COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD Y METODO ELISA ( PAPRIKA) 1.- Extraccin de la muestra: 1.1 Pese 20g de la muestra molida y colquela en un frasco de vidrio ( 250 ml) con tapa. 1.2 Agregue al frasco 100 mL de metanol:1% bicarbonato de sodio (70:30) En un frasco aparte se prepar una solucin de bicarbonato al 1% ( 1g de bicarbonato de sodio con 100ml de agua destilada), de esta solucin se midi 30ml y se coloc en otro frasco, luego se aadi 70ml de metanol . 1.3 Usar licuadora para realizar la extraccin ( licuar por 1 min). Tambin se puede usar el siguiente procedimiento ( Colocar la preparacin anterior en un frasco , tapar el frasco , mezclar vigorosamente por 3 m inutos y esperar que sedimente por 3 min. 1.4 Filtrar el contenido con papel whatman N 4 ( o papel aflautado) usando embudo de vidrio y vaso de 250ml, , primero filtrar el sobrenadante y luego la porcin mas espesa pero siempre se filtr todo el contenid o. 1.5 El extracto obtenido , volver a filtrarlo, pero esta vez con el papel whatman N1. 2.-Dilucin del Extracto: 2.1 Pipetee o vace ( 10 ml) del extracto filtrado dentro de un recipiente limpio. 2.2Diluya el extracto con ( 30ml de PBS) Mezcle bien. 3.-Cromatografa de Columna: 3.1 Acondicionar la columna, pasar 10 ml de PBS y dejando aprox 0,5 ml de esta solucin . 3.2 Pase 20ml ( 20ml = 1,0g) completamente a travs de la columna de afinidad OchraTest a razn de 1 a 2 gotas/segundo . 3.3 Pase 10 mL de PBS/ a travs de la columna aproximadamente, pase aire por aprox 5 seg. a razn de 2 gotas/segundo

3.4 Repetir el lavado con 10ml de PBS un ratio de 1 -2 gotas/segundo, despus pase aire por aproximadamente 5 seg o hasta que no quede restos de agua . 3.5 Eluya la columna de afinidad pasando 2,0 mL de metanol al 100% a travs de la columna a razn de 1 a 2 gotas/segundo y recolecte toda la muestra de eluato en un vial mbar y por ltimo pasar 2ml de agua destilada, obtenindose en el vial un total de 4ml. 3.6 Esta solucin obtenida se utiliza directamente para ELISA competitivo.

4.-METODO ELISA 4.1 A cada pozo verde se adiciona 50uL de los 5 controles y de cada muestra que se analizar. 4.2 Se adiciona 100ul del conjugado con la pipeta y mezclar introduciendo la pipeta multicanal y mezclar por aspiracin 3 veces. 4.3 De esto se transfiere 100ul a los pozos transparentes que contienen el anticuerpo , se agita suavemente por deslizamiento en superficie plana por 10 a 20 segundos y se incuba por 10 minutos a temperatura ambiente y en cmara oscura. 4.4 Despus de la incubacin se desecha el contenido de los pozos, se golpea enrgicamente los pozos sobre papel toalla para eliminar restos lquidos. 4.5 Usando la piceta, se agrega agua destilada a los pozos y se deja reposar por 2 segundos y se desecha. 4.6 Se adiciona 100ul del substrato a todo los pozos, se agita por desplazamiento 10 a 20 segundos, se incuba por 10 minutos a temperatura ambiente y obligatoriamente en oscuridad. 4.7 Finalmente se adi ciona 100ul de solucin stop a todo los pozos, luego se deja reposar por 1 minuto y medio antes de realizar la lectura. 4.8.Pasar al lector usando un filtro de 450 nm.. 4.9 En la computadora transformar las densidades pticas en ppb,

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PROCEDIMIENTO TECNICA DE PURIFICACION CON EL USO DE LAS COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD ( PAPRIKA), METODO ELISA 1.- Extraccin de la muestra: 1.1 Pese 20g de la muestra molida mas 5 gr de sal ( NaCl) y colquela en un frasco de vidrio con tapa. 1.2 Agregue al frasco 100 ml de metanol al 80% ( metanol:agua 80:20) 1.3 Usar licuadora para realizar la extraccin ( licuar por 1 min). Tambin se puede usar el siguiente procedimiento ( Colocar la preparacin anterior en un frasco , tapa r el frasco , mezclar vigorosamente por 3 minutos y esperar que sedimente por 3 min. utos y esperar que sedimente por 3 min. 1.4 Filtrar el contenido con papel whatman N 4, ( papel aflautado) usando embudo de vidrio y vaso de 250ml, , primero filtrar el sobrenadante y luego la porcin mas espesa pero siempre se filtra todo el contenido. 1.5 El extracto obtenido , volver a filtrarlo, pero esta vez con el papel whatman N1 2.-Dilucin del Extracto: 2.1 Pipetee o vace 10 ml del extracto filtrado dentro de u n recipiente limpio. 2.2Diluya el extracto con (30 mL de PBS) Mezcle bien. 3.-Cromatografa de Columna: 3.1 Acondicionar la columna, pasar 10 ml de PBS y dejando aprox 0,5 ml de esta solucin . 3.2 Pase (20 ml ) del extracto diluido filtrado ( 20mL = 1,0 g de muestra) completamente a travs de la columna de afinidad AflaTest a razn de 1 a 2 gotas/segundo . 3.3 Pase 10 mL de PBS/ a travs de la columna aproximadamente, pase aire por aprox 5 seg. a razn de 2 gotas/segundo

3.4 Repetir el lavado con 10ml de PBS un ratio de 1 -2 gotas/segundo, despus pase aire por aproximadamente 5 seg o hasta que no quede restos de agua. 3.5 Eluya la columna de afinidad pasando 2,0 mL de metanol al 100% a travs de la columna a razn de 1 a 2 gotas/segundo y recolecte t oda la muestra de eluato en un vial mbar, luego para el lavado final pasar 2ml de agua destilada, obtenindose en el vial un total de 4ml. 3.6 Esta solucin obtenida se utiliza directamente para ELISA competitivo.

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1.-EXTRACION DE LA MUESTRA 1.1 Pese 25g de la muestra mas 5 gr de sal ( NaCl) y colquela en un frasco de vidrio con tapa. 1.2 Agregue al frasco 125 ml de metanol : agua 60:40 1.3 Usar licuadora para realizar la extraccin ( licuar por 1 min). Tambin se puede usar el siguiente procedimiento ( Colocar la preparacin anterior en un frasco , tapar el frasco , mezclar vigorosamente por 3 minutos y esperar que sedimente por 3 min. 1.4 Filtrar el contenido con papel whatman N 4, ( papel aflautado) usando embudo de vidrio y vaso de 250ml, , primero filtrar el sobrenadante y luego la porcin mas espesa pero siempre se filtra todo el contenido. 1.5 El extracto obtenido , volver a filtrarlo, pero esta vez con el papel whatman N1 2.-Dilucin del Extracto: 2.1 Pipetee o vace 20 ml del extracto filtrado dentro de un recipiente limpio. 2.2Diluya el extracto con (20 mL de PBS) Mezcle bien. 3.-Cromatografa de Columna: 3.1 Acondicionar la columna, pasar 10 ml de PBS y dejando aprox 0,5 ml de esta solucin . 3.2 Pase (10 ml ) del extracto diluido filtrado ( 10mL = 1,0 g de muestra) completamente a travs de la columna de afinidad AflaTest a razn de 1 a 2 gotas/segundo . 3.3 Pase 10 mL de PBS/ a travs de la columna a razn de 2 gotas/segundo aproximadamente, pase aire por a prox 5 seg. 3.4 Repetir el lavado con 10ml de PBS un ratio de 1 -2 gotas/segundo, despus pase aire por aproximadamente 5 seg o hasta que no quede restos de agua. 3.5 Eluya la columna de afinidad pasando 2,0 mL de metanol al 100% a travs de la columna a razn de 1 a 2 gotas/segundo y recolecte toda la muestra de eluato en un vial mbar, luego pasar para el lavado final 2ml de agua destilada, obtenindose en el vial un total de 4ml. 3.6 Esta solucin obtenida se utiliza directamente para ELISA competiti vo.

OCRATOXINA OLEORRESINA PAPRIKA

1.- Extraccin de la muestra: 1.1 Pese 25g de la muestra y colquela en un frasco de vidrio ( 250 ml) con tapa. 1.2 Agregue al frasco 100 mL de metanol:1% bicarbonato de sodio (70:30) En un frasco aparte se prepar una solucin de bicarbonato al 1% ( 1g de bicarbonato de sodio con 100ml de agua destilada), de esta solucin se midi 30ml y se coloc en otro frasco, luego se aadi 70ml de metanol . 1.3 Usar licuadora para realizar la extraccin ( licuar por 1 min) . Tambin se puede usar el siguiente procedimiento ( Colocar la preparacin anterior en un frasco , tapar el frasco , mezclar vigorosamente por 3 minutos y esperar que sedimente por 3 min. 1.4 Filtrar el contenido con papel whatman N 4 ( o papel aflautado ) usando embudo de vidrio y vaso de 250ml, , primero filtar el sobrenadante y luego la porcin mas espesa pero siempre se filtr todo el contenido. 1.5 El extracto obtenido , volver a filtrarlo, pero esta vez con el papel whatman N1. 2.-Dilucin del Extracto: 2.1 Pipetee o vace ( 20 ml) del extracto filtrado dentro de un recipiente limpio. 2.2Diluya el extracto con ( 20 ml de PBS) Mezcle bien. 3.-Cromatografa de Columna: 3.1 Acondicionar la columna, pasar 10 ml de PBS y dejando aprox 0,5 ml de sta solucin . 3.2 Pase (10 ml ) del extracto diluido filtrado (10mL = 1,0 g muestra) completamente a travs de la columna de afinidad OchraTest a razn de 1 a 2 gotas/segundo . 3.3 Pase 10 mL de PBS/ a travs de la columna a razn de 2 gotas/segundo aproximadamente, pase aire por aprox 5 seg. 3.4 Repetir el lavado con 10ml de PBS un ratio de 1 -2 gotas/segundo, despus pase aire por aproximadamente 5 seg o hasta que no quede restos de agua. 3.5 Eluya la columna de afinidad pasando 2,0 mL de metanol al 100% a travs de la columna a razn de 1 a 2 gotas/segundo y recolecte toda la muestra de eluato en un vial mbar y por ltimo se pas para el lavado final con 2ml de agua destilada, obtenindose en el vial un total de 4ml. 3.6 Esta solucin obtenida se utiliz a directamente para ELISA competitivo.