MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA #6

Achicanoy Burbano Angie Magdalena-218035001 ,

Cabrera Carpio María Belén-218035046 
Callejas Gomez Allison Mariana -218035050 
Chamorro Vallejo Gloria Carima-218035067 

FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 

Universidad de Nariño
Pasto - Colombia

Aislamiento y caracterización de ​Bacillus cereus ​en alimentos y ambiente

Resultados hipotéticos

Suponga que después del proceso de aislamiento y tinción de Gram, observa al

microscopio las siguientes imágenes. ¿Qué microorganismo seleccionaría como posible
Bacillus cereus ​y por qué? Describa la cepa seleccionada a nivel de tinción, morfología y
agrupación.
RTA: ​La cepa que se seleccionaria como posible ​Bacillus cereus ​sería la ​cepa N° 2 ​ya que
su tinción es de una coloración gram positiva, se puede observar su forma irregular y borde
lobulado y también la espora oval-central que produce este tipo de microorganismo.

ACTIVIDAD HEMOLÍTICA
Solución:
CUESTIONARIO
1.Consultar mecanismo infeccioso de Bacillus cereus

MECANISMOS DE PATOGENICIDAD

Los dos tipos de intoxicación alimentaria por ​B. cereus​ son causados ​por tipos muy
diferentes de toxinas. La toxina emética, que causa el vómito, ha sido aislada y
caracterizada recientemente, mientras que la enfermedad diarreica es causada por al
menos tres enterotoxinas diferentes.

La toxina emética
La toxina emética sólo causa emesis (vómitos) y su estructura ha sido un misterio durante
mucho tiempo, ya que el único sistema de detección involucró a primates vivos. El reciente
descubrimiento de que la toxina podría detectarse (actividad de vacuolización) mediante el
uso de células HEp-2, ha llevado a su aislamiento y determinación de su estructura. Aunque
ha habido algunas dudas sobre si la toxina emética y el factor vacuolante son el mismo
componente, no hay duda de que es la misma toxina. La toxina emética se ha denominado
cereulida y consta de una estructura de anillo de tres repeticiones de cuatro aminoácidos y /
o oxiácidos: [ D - ​O-​ Leu- D -Ala- L - ​O​ -Val- L -Val ] ​3​ . Esta estructura de anillo
(dodecadepsipéptido) tiene una masa molecular de 1,2 kDa y está estrechamente
relacionada químicamente con el ionóforo de potasio valinomicina. La toxina emética es
resistente al calor, pH y proteólisis, pero no es antigénica. La vía biosintética y el
mecanismo de acción de la toxina emética aún deben dilucidarse, aunque recientemente se
ha demostrado que estimula el aferente vago mediante la unión al receptor 5-HT ​3​. No está
claro si la toxina es un producto génico modificado o si se produce enzimáticamente
mediante la modificación de componentes en el medio de crecimiento. Sin embargo, con tal
estructura, lo más probable es que la cereulida sea un péptido sintetizado enzimáticamente
y no un producto genético.

Enterotoxinas
El número de enterotoxinas y sus propiedades también se han debatido durante mucho
tiempo, pero se han caracterizado al menos tres enterotoxinas diferentes. Sin embargo, no
hay evidencia de que la enterotoxina T, recientemente reportada cause intoxicación
alimentaria. Los primeros estudios sobre la enterotoxina sugirieron una enterotoxina de uno
o varios componentes. El trabajo adicional ha demostrado ahora que ​B. cereus​ produce dos
enterotoxinas de tres componentes diferentes. Una hemolisina de tres componentes (HBL;
que consta de tres proteínas: B, L ​1​y L ​2​ ) con actividad de enterotoxina se ha purificado y
caracterizado. Esta toxina también tiene actividades de permeabilidad vascular y
dermonecrótica, y provoca la acumulación de líquido en las asas ileales de conejo ligadas.
Por tanto, se ha sugerido que el HBL es un factor de virulencia primario en la diarrea por ​B.
cereus.​ Evidencia convincente ha demostrado que los tres componentes son necesarios
para la actividad máxima de enterotoxina. Recientemente Lund y Granum caracterizaron
una enterotoxina de tres componentes no hemolítica (NHE). Los tres componentes de esta
toxina eran diferentes de los componentes de HBL. Las características de las dos
enterotoxinas de tres componentes se dan en la ​Tabla​ junto con la información disponible
sobre la enterotoxina T.

​
2 Características​ de las tres enterotoxinas de ​B. cereus a

Enterotoxina Enterotoxina Enterotoxina

HBL NHE T

Número de componentes 3 3 1

Tamaño de los componentes activos

L ​2 46 kDa 45 kDa 41 kDa

L ​1 38 kDa 39 kDa

segundo 37 kDa 105 kDa

Hemolítico si No No

Toxicidad en pruebas celulares 80 ng 70 ng No

determinado

Se muestra involucrado en intoxicación si si No

alimentaria.

Clonado y secuenciado si No si
Los tres componentes de la enterotoxina NHE se purificaron por primera vez a partir de una
cepa de ​B. cereus​ aislada después de un gran brote de intoxicación alimentaria en Noruega
en 1995. Esta cepa se utilizó para caracterizar el NHE principalmente porque no producía el
componente L ​2​ . Esperábamos mostrar que el componente L ​2​ era innecesario para la
actividad biológica de la enterotoxina HBL, pero en su lugar encontramos otra enterotoxina
de tres componentes. La combinación binaria de los componentes de esta enterotoxina
posee cierta actividad biológica, pero no tan alta como cuando todos los componentes están
presentes.

Algunas cepas producen las dos enterotoxinas de tres componentes, mientras que otras
cepas contienen genes para sólo una de ellas. En la actualidad desconocemos la
distribución de los dos complejos de enterotoxinas entre las cepas, ni la importancia de
cada uno de ellos en relación con la intoxicación alimentaria. Sin embargo, parece que
ambos son importantes. Recientemente se ha demostrado que el gen de la enterotoxina T
está ausente en 57 de 95 cepas de ​B. cereus​ y en cinco de siete cepas implicadas en
intoxicación alimentaria.

Se ha sugerido, a partir de estudios de interacciones con eritrocitos, que la proteína B es el

componente que une HBL a las células diana, y que L ​1​ y L ​2​ tienen funciones líticas.
Recientemente, se propuso otro modelo para la acción de HBL, lo que sugiere que los
componentes de HBL se unen a las células diana de forma independiente y luego
constituyen un complejo que ataca la membrana que da como resultado un mecanismo de
lisis osmótica coloide. Los estudios de interacciones entre las células NHE y Vero han
demostrado que la proteína de 105 kDa podría ser el componente de unión de ese
complejo. Es probable que los otros dos componentes no puedan unirse a estas células por
sí solos. Todavía no está claro si los dos complejos de toxinas diferentes solo dañan las
membranas plasmáticas de las células diana o si algunos de los componentes se traslocan
al citosol y tienen actividad lítica dentro de la célula.

Existe un alto grado de identidad entre la parte N-terminal de L ​1​ y la parte correspondiente
de la proteína de 39 kDa, y también existe una alta identidad entre las partes de L ​2​ y la
proteína de 45 kDa ( ​Tabla 3​ ). También se ha informado de que los anticuerpos contra la
proteína B reconocen una proteína de aproximadamente 100 kDa. Si esta proteína es la
misma que la proteína de 105 kDa de NHE, partes de la proteína de 105 kDa pueden ser
muy similares a partes de la proteína B. Juntas, estas observaciones indican algunas
similitudes entre HBL y NHE.

3 Secuencias​ N-terminales de las proteínas de 45 kDa y 39 kDa del NHE

45 kDa AQNVIAPNTL ​S​ N ​S​ I ​R​ M ​LG​ S ​QS​ P ​LIQ​ A ​Y​ G

39 kDa AESTVKQAPVXAVAKAYNDYEE ​Y​ S ​LGPEGLK​ D ​A​ MEX ​TGS​ NA ​LVMD

Los residuos dados en negrita representan residuos idénticos en L ​2​ (para la proteína de 45
kDa) y L ​1​ (para la proteína de 39 kDa).

Referencias

● Per Einar Granum - ​Cartas de microbiología de FEMS​ , volumen 157, número 2,

diciembre de 1997, páginas 223–228, (Publicado: 01 de diciembre de 1997)
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1997.tb12776.x

2.¿Qué medidas de control se emplean para evitar la contaminación de alimentos con

Bacillus cereus?

El control y prevención de enfermedades por B.cereus involucra la atención prioritaria de

diferentes factores que pueden promover la contaminación en diferentes fases de la cadena
de producción de alimentos:

● Agentes físicos ​mediante la aplicación de diferentes condiciones​ de presión​, el

tratamiento de las esporas de B. cereus con presión moderada y calor, causa la
inactivación y,por ende, una menor germinación de las esporas.
Refrigerar​ de forma rápida los alimentos cocinados, conservar y manipular por
debajo de 7ºC la materia prima, la semielaborada y los alimentos elaborados.
● Disminuir el pH y la actividad de agua​ del alimento elaborado, ya que de esta
manera se limita el crecimiento de la bacteria, que no crece a pH inferior a 5 ni a una
actividad de agua inferior a 0,93.
● Es fundamental l​a limpieza ​de los equipos utilizados para disminuir el riesgo de
contaminación. ​Evitar un almacenamiento prolongado​ de la materia prima y los
productos ya elaborados. Es necesario realizar rotaciones para evitarlo.
● Agentes biológicos​ a través del uso de microorganismos como son las ​bacterias
ácido lácticas y/o metabolitos,polímeros ​(quitosano u oleorresinas), compuestos
fenólicos presentes en extractos y aceites esenciales de origen vegetal.
 ● Agentes químicos​ como conservadores químicos (benzoatos, acetatos, nitratos,
nitritos, anhídrido sulfuroso, entre otros).
● Seleccionar ​solo las ​materias primas ​con concentraciones iniciales de B. cereus
inferiores a 103 ufc/g (unidades formadoras de colonia por gramo).

Referencias.

Cortés-Alejandro De Jesús ,Guzmán-Sánchez Cynthia A.(2018). About Bacillus cereus and

food safety (a review)
http://www.scielo.org.co/pdf/rcien/v22n1/0121-1935-rcien-22-01-00093.pdf

Castañeda- Laura M, Correa-Margarita,Sánchez- Jennifer. (2016) Bacillus cereus un

patógeno importante en el control microbiológico de los alimentos.
http://www.scielo.org.co/pdf/rfnsp/v34n2/v34n2a12.pdf

Gimferrer-Natalia (2011)Qué es Bacillus cereus y cómo

prevenirlo.​https://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/que-es-bacillus-cereus-y-como-pr
evenirlo.html

3.¿Cuáles son los métodos más empleados para la identificación de Bacillus cereus?

- Pruebas bioquímicas: ​Son pruebas de confirmación como la hemólisis, movilidad,

catalasa, tinción Gram, metabolismo de manitol, metabolismo de glucosa, entre
otras.
- Pruebas fenotípicas: ​Bacillus cereus puede ser aislado e identificado en muestras
alimenticias en el medio de cultivo MYP. La característica principal para la
identificación de B. cereus en este medio es la formación de un precipitado blanco,
alrededor de las colonias que crecen de color rosa, el cual corresponde a la hidrólisis
de lecitina en el medio por B. cereus. El rojo de fenol se utiliza para detectar cambios
de pH en el medio producto de la fermentación del manitol; las colonias que crecen
de coloración amarilla, resultado del descenso de pH del medio por la fermentación
del manitol, no corresponden a colonias de B. cereus, y la polimixina determina la
selectividad del medio puesto que inhibe a las bacterias Gram negativas.
- Pruebas moleculares: ​Actualmente las pruebas moleculares, como la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (pcr), constituyen una gran alternativa a los métodos
tradicionales por su utilidad para la detección e identificación de microorganismos
contaminantes de alimentos. Estas metodologías tienen como ventajas su alta
sensibilidad, especificidad, precisión, reproducibilidad, rapidez y sencillez en su
ejecución. En la actualidad se encuentran ensayos basados en la pcr convencional o
variaciones de esta, como la pcr múltiple y la pcr en Tiempo Real para detectar
cepas de B. cereus por la presencia de genes específicos o aquellos que codifican
para sus toxinas.
- Pruebas celulares: ​para detectar las toxinas a través del efecto lesivo que provocan
en cultivos celulares in vitro, se han utilizado los siguientes: cultivo de células
McCoy, cultivos de células CHO, o cultivos de células Hep-2. En los cultivos
celulares se produce un efecto citopático sobre su proliferación o una vacuolización.
Referencias
 ● Sánchez, Castañeda, Correa. (Mayo de 2016). Bacillus cereus un patógeno
importante en el control microbiológico de los alimentos. Recuperado de
http://www.scielo.org.co/pdf/rfnsp/v34n2/v34n2a12.pdf

4.¿Cuáles son los hábitat natural más comunes de Bacillus cereus?

Las especies de Bacillus se encuentran ampliamente distribuidas tanto en ecosistemas

acuáticos como terrestres, e incluso en ambientes bajo condiciones extremas
Sin embargo,​ el suelo​ es considerado el principal reservorio de este género bacteriano,
debido a que la mayoría de especies de Bacillus son saprófitas pudiendo utilizar la gran
diversidad de sustratos orgánicos presentes en el suelo, siendo ésta una matriz compleja
para el establecimiento de una gran diversidad genética y funcional de especies
microbianas
Otros hábitats naturales comunes de esta bacteria son el ​agua, vegetación y aire​, desde
los cuales al igual que en el suelo se transfiere muy fácilmente a los alimentos.

Referencias

Alvarado-María Isabel Estrada​,Chávez-Luis Alberto Cira,Cota-Fannie Isela

Parra,Delgado-María Fernanda Villarreal,Rodríguez-Eber Daniel Villa,Villa-,Eber Daniel
(2018) El género Bacillus como agente de control biológico y sus implicaciones en la
bioseguridad agrícola.
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0185-33092018000100095

Pérez Portuondo-. Irasema (2012) Bacillus cereus y su papel en las intoxicaciones

alimentarias . ​https://www.scielosp.org/pdf/rcsp/2012.v38n1/98-108/es