REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR Y ELECTROFORESIS
RESUMEN Thermocycler. To amplify the 16S rRNA gene,
Introduccin: Escherichia coli, es una bacteria
Gram negativa de la familia de las
Enterobacteriaceae, siendo una bacteria anaerobia
facultativa comensal ms abundante de la
microbiota. E. coli es organismo estable, que ha
cambiado poco morfolgicamente. El genoma de
Escherichia coli consiste en un solo cromosoma
circular, el cual suma 4 -.403 genes.
Materiales y mtodos: se decant el
sobrenadante y se resuspendi la pastilla
microbiana en buffer TE (Tris HCl; EDTA),
posteriormente se agreg SDS al 10% y
protenasa K, en la etapa de extraccin y
purificacin se mantuvo las muestras a una baja
temperatura, luego se prepar un coctel para PCR
utilizando los volmenes de reactivos indicados
en la tabla 1, llevndolos al Termociclador. Para
amplificar el gen ARNr 16S, se utilizaron dos
juegos de cebadores especficos: FD2 y RP1.
Resultados y Discusin : las muestras 2, 5, 6, 7 y
8 presentaron un resultado positivo, presentando
un corrido de bandas inicial de 500pb, alcanzando
a llegar a los 1500pb; en cambio las muestras 3 y
4 no dieron el resultado esperado, por ende no se
apreci el corrido de las bandas de ADN.
Conclusin: La PCR se apoya en la propiedad
natural de las ADN polimerasas para replicar
hebras de ADN, aplicndoseles ciclos de altas y
bajas temperaturas alternadas para realizar la
separacin de las hebras de ADN.
Palabras claves: Escherichia coli, anaerobia
facultativa, mtodos moleculares, PCR.
ABSTRACT
Introduction: Escherichia coli is a gram negative
bacterium of the Enterobacteriaceae family, being
a more frequent commensal anaerobic bacteria of
the microbiota. E. coli is a stable organism, which
has changed little morphologically. The genome
of Escherichia coli consists of a single circular
chromosome, which adds 4-.403 genes.
Materials and methods: the supernatant was
decanted and the microbial "pellet" was
resuspended in TE buffer (Tris-HCl; EDTA), then
10% SDS and K protein were added, in the
extraction and purification step the samples were
kept at A low temperature, then a cocktail was
prepared for PCR using the volumes of reagents
indicated in table 1, taking them to the
two sets of specific primers were used: FD2 and
RP1.
Results and Discussion: Samples 2, 5, 6, 7 and 8
presented a positive result, presenting an initial
bandwidth of 500bp, reaching 1500bp; On the
other hand samples 3 and 4 did not give the
expected result, therefore the DNA bands were not
appreciated.
Conclusion: The PCR relies on the natural
property of DNA polymerases to replicate DNA
strands, applying cycles of high and low
alternating temperatures to perform separation of
strands of DNA.
Key words: Escherichia coli, facultative
anaerobic, molecular methods, PCR.
INTRODUCCIN
Escherichia coli, es una bacteria Gram
negativa de la familia de las
Enterobacteriaceae, estudios moleculares
indican que pertenece a la subclase g de las
Proteobacterias. Las enterobacterias se
caracterizan por ser capaces de respirar en
forma facultativa; en el ambiente exterior son
anaerobias. Gracias a esta capacidad muchos
de los miembros de esta familia son de vida
libre, mientras que otras son comensales de
animales o plantas. Por lo general E. coli
utiliza azucares sencillos como la glucosa, y
produce cidos y gas en presencia de lactosa
y requiere nitrgeno soluble.1
E. coli es la bacteria anaerobia facultativa
comensal ms abundante de la microbiota;
asimismo, es uno de los organismos
patgenos ms relevantes en el hombre, tanto
en la produccin de infecciones
gastrointestinales como de otros sistemas
(urinario, sanguneo, nervioso).AB

Los genomas recientemente secuenciados de
Escherichia coli y los estudios de gentica de
poblaciones indican de manera definitiva que
estas bacterias no son el organismo estable,
E. coli ha cambiado poco morfolgicamente,
su genoma es una entidad dinmica y
cambiante que no ha dejado de evolucionar,
manteniendo un tamao reducido y una
aparente baja complejidad.C
Escherichia coli se encuentra normalmente en
el intestino del ser humano y de los animales
de sangre caliente. La mayora de las cepas de
E. coli son inofensivas. Sin embargo algunas
de ellas, producen la toxina Shiga, que causa
graves enfermedades y se transmite a travs
de los alimentos. Se creera que la presencia
de E. coli no tiene una funcin especialmente
relevante en el cuerpo humano, sin embrago
se lleg a describir que la bacteria E. coli
favorece a la absorcin de algunas vitaminas,
especialmente la vitamina K (Marimn,
2014).3
El genoma de Escherichia coli consiste en un
solo cromosoma circular, el cual suma 4
-.403 genes, con un total de 4.639.221 pares
de bases de ADN. An Se desconoce la
funcin de un tercio de estos genes.2
Los mtodos moleculares ofrecen mejoras
ante la necesidad de detectar bacterias como
E. coli con efectividad y rapidez; frente a las
limitaciones que se han indicado de los
mtodos convencionales, las tcnicas
moleculares destacan por la posibilidad de
disear un mtodo en el que se pueda detectar
de forma sensible y especfica la bacteria
objeto de estudio en un plazo corto (menos de
24 horas) con un coste ajustado. El empleo
de mtodos como la PCR a Tiempo Real es el
que sirve de base para muchas tcnicas de
deteccin de patgenos, entre las que se
encuentran la deteccin de Escherichia coli
enterotoxignico en adelante STEC
incluyendo los E. coli enterohemorrgicos.
El mtodo analtico consiste en primer lugar
en la preparacin de muestra en alimentos
acorde a los protocolos habitualmente
establecidos en funcin del tipo de matriz
objeto de anlisis. Posteriormente se somete
la muestra a un enriquecimiento a 37C
durante 18 horas, en el que pueden emplearse
diversos caldos como: TBS modificado
adicionado con acriflavina para productos
lcteos. Agua
peptona tamponada para muestras que pueden
contener capas estresadas como los alimentos
congelados y con poca microflora
acompaante.
TBS modificado adicionado con
novobiocina en el caso de muestras con altos
niveles de flora acompaante.
Despus del enriquecimiento se realiza una
extraccin de cidos nucleicos y purificacin
de los mismos y, finalmente, la amplificacin
y deteccin simultanea de fragmentos
genticos propios de las STEC.
Los genes seleccionados en una primera fase
de cribado son los genes stx1 y stx2 que
codifican la toxina Shiga, siendo el gen stx2
el que se ha asociado ms habitualmente con
enfermedades graves en humanos, as como
del gen eae que codifica la intimina
relacionada con el mecanismo de adhesin de
la bacteria.
En posteriores etapas y a partir de muestras
positivas, se procede al aislamiento en medios
de cultivo adecuados, como el medio CT-
SMAC (Agar Cefiximida telurito sorbitol
McConkey) incubado a 37C durante 24-48
horas, as como otros medios a eleccin del
laboratorio.
La presencia de colonias tpicas en estos
medios de cultivo en las que se confirma la
existencia de alguno de estos genes, permite
concluir la presencia de STEC
potencialmente patognicos en la muestra
analizada.
Todas estas etapas analticas incorporan
controles analticos que permiten garantizar la
fiabilidad de la tcnica mediante el empleo de
controles internos para detectar inhibiciones
de la seal de PCR, de cepas de referencia
con resultados positivos as como controles
negativos para comprobar la ausencia de
contaminaciones cruzadas en el laboratorio. D
Agar MacConkey: separa las bacterias
fermentadoras de la lactosa. Escherichia coli
produce colonias rosadas.
La PCR hace posible la sntesis de grandes
cantidades de un fragmento de ADN sin tener
que clonarlo, la reaccin en cadena de la
polimerasa. Con esta se consigue copiar
millones de veces, en un par de horas, una
secuencia predeterminada, dentro de una
mezcla de ADN tan compleja como el propio
genoma humano, donde la secuencia de
inters representa tan solo una
diezmillonsima. Aplicndose en diferentes
reas de las ciencias biolgicas y de la salud,
formando parte del quehacer cientfico de
muchos laboratorios de investigacin que la
utilizan principalmente para expresin gnica,
genotificacin, deteccin de patgenos y
anlisis de mutaciones.4 El objetivo principal
es describir las pautas y recomendaciones
generales para la preparacin de reaccin en
Cadena de Polimerasa (PCR). Amplificando
un fragmento de ADN de E. coli, utilizando
cebadores especficos FD2 y RP1.
MATERIALES Y METODOS
EXTRACCIN DE ADN (E. COLI).
Para la primera extraccin de ADN se
decant el sobrenadante y se resuspendi la
pastilla microbiana en buffer TE (Tris
HCl; EDTA), posteriormente se agreg SDS
al 10% y protenasa K todos estos
componentes inhiben la accin y
desnaturalizan las enzimas nucleasas. Con la
utilizacin de estos componentes se pretendi
degradar aquellos compuestos que no son de
inters.
EL SDS adems de las funciones ya descritas
permite romper a membrana celular y nuclear
y liberar el cido nucleico, y a proteinasa K
libera el ADN de las histonas donde se
encuentran protenas que lo mantienen
empaquetado.
Durante la etapa de extraccin y purificacin
se mantuvo las muestras a una baja
temperatura lo cual resulto apropiado ya que
es una variable importante para mantener
integro el ADN aislado.
Cabe mencionar que durante el proceso de
extraccin y separacin de ADN involucro
agitacin mecnica, que ayudo a la
separacin de las dos cadenas de ADN ya que
se genera un flujo hidrodinmico. Adems
que la molcula de E. coli es larga y se
requiere una fuerza dbil para ocasionar su
ruptura.
AMPLIFICACIN DE ADN DE E.
COLI (PCR)
Para determinar la presencia de ADN de E.
coli, se prepar un coctel para PCR utilizando
los volmenes de reactivos indicados en la
tabla 1, En un tubo Eppendorf se deposit el
coctel junto con la muestra de ADN y se llev
al Termociclador, Se ingres el protocolo a
seguir en el termociclador de acuerdo a la
tabla 2. El termociclador realiza todo el
proceso de alternancia de temperaturas de
manera automtica segn lo especificado en
el programa, proporcionando el ambiente
propicio para la accin de la ADN
polimerasa. El programa se divide en tres
etapas que implican cambios de temperatura,
as por ejemplo, en la etapa de
desnaturalizacin del ADN, la temperatura
aumenta hasta los 94 C, rompiendo los
puentes de hidrogeno y separando las dos
hebras de ADN, luego la temperatura
desciende hasta 52 C en la etapa de
hibridacin y los primers se alinean a sus
secuencias de ADN complementarias,
marcando el lugar de inicio para la Taq
polimerasa, en la etapa de extensin la
 temperatura desciende hasta 52 C y en este
momento la Taq polimerasa comienza a
adicionar nucletidos en el extremo 3 del
primer, la longitud de la secuencia depender
del tiempo empleado, 20 segundos
normalmente se usan para fragmentos de
ADN de 500 pares de bases y tiempos
mayores a 40 segundos para fragmentos por
encima de 1200 pares de bases.
Para la amplificacin del gen ARNr 16S, se
utilizaron dos juegos de cebadores
especficos: FD2 y RP1
Cebador Secuencia
FD2 5AGAGTTTGATCATGGCTCAG3
RP1 5 ACGGTTACCTTGTTACGCTT3
Determina Genero de E. coli
muestras se sometieron a un voltaje de 90
voltios durante 60 minutos para
posteriormente llevar la placa al
transiluminador para su observacin.
Se emple el Sybr safe como colorante para
la visualizacin del ADN en la electroforesis
con geles de agarosa. Este se asocia a la
molcula de ADN interactuando con la
hendidura menor del ADN. Esta molcula se
introduce en la estructura secundaria de la
doble hlice del ADN y se acopla
energticamente a los cidos nucleicos de
ste, de manera que se incrementa
notablemente su tasa de emisin fluorescente.
Mientras que el Orange G se utiliz como un
marcador de color para controlar el proceso
de electroforesis en gel de agarosa, corriendo
aproximadamente al tamao de 50 pb de una
molcula de ADN

ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA
Para determinar si existi amplificacin del
gen deseado se realiz una electroforesis en
gel de agarosa al 2%, y para esto se diluy 1
g de agarosa en buffer TBE 0.5X, formando
una solucin de color blanco, que luego se
llev a un vortex magntico con placa
calentadora y se someti a una temperatura
inicial de 267 C, y luego de transcurridos
aproximadamente 22 minutos, la solucin
estaba completamente transparente y registr
una temperatura de 83C la cual se
monitoreaba constantemente mediante un
termmetro de mercurio. Una alta Tabla 1. Se muestran los volmenes de reactivos
concentracin de agarosa supone que las utilizados en la preparacin del coctel.
molculas de ADN que se desean separar
electroforticamente tienen un bajo peso
molecular debido a que la estructura que
forman las molculas del gel contiene poros
ms pequeos por los que las molculas de
menor tamao se mueven con mucha ms
facilidad, alcanzando mayores distancias; las
Tabla 2. Se muestra el protocolo a ingresar en el
Temociclador para cada etapa de la PCR.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Al finalizar el experimento de PCR y la
electroforesis en el gel de agarosa al 2% se
obtuvo el siguiente resultado:
2000
1500
700
500
1 2 3 4 5 6
Posos con muestras de cada grupo
1. Marcador molecular; 2. Grupo 1; 3. Grupo 2;
4. Grupo 3*; 5. Grupo 4; 5. Grupo 5(J. d
Dios); 6. Grupo 7; 8. Prueba control.
Nota: Grupo 3* muestra a discutir
Fig. 1. Se muestra la placa de agarosa (2%) dentro
del Transiluminador, ntese las bandas de ADN en
color claro cuyo peso molecular oscila los 1200
pb, los nmeros del 1 al 8 representan los pozos
cargados con las muestras de ADN que obtuvo
cada grupo, y marcador molecular contiene el
control positivo.
Fig. 2. Marcador molecular utilizado para
determinar los corridos en Pb de las bases en
genes de ADN E. Coli.
Se puede observar que en la electroforesis
realizada en laboratorio se muestran bandas
corridas a lo largo del gel utilizado (Agarosa
al 2%), dando como resultado un extraccin
positiva de ADN para algunas muestras, y al
realizar una comparacin con el patrn de
bandas se puede estimar que la muestra #2 se
encuentra entre 600 y 600 pb, #3 0 pb, #4 0
pb, #5 se encuentra entre 500 y 700pb, #6
encuentra entre 500 y 2000pb #7 encuentra
entre500 y 2000pb y la #8 encuentra entre
1200 y 1500pb.
Tabla 3. Muestras con el corrido de la
electroforesis; donde se evidencia que las
muestras 2, 5, 6, 7 y 8 corrieron positivamente,
presentando diferentes pares de bases, en cambio
las muestras 3 y 4 no corrieron.
Se pueden ver algunas bandas como la del
grupo 2 y 6 que fueron ms anchas y visibles,
esto se pudo deber a que tienen una mayor
concentracin de ADN y el mismo nmero de
pb que los dems grupos(5, 7 y 8; que son
menos visibles) , a pesar que se amplific el
mismo fragmento de ADN. Sin embargo, a unir las dos hebras para que se dupliquen
tambin hay bandas menos ntidas y gruesas nuevamente.
que otras; en este sentido el grupo 5 obtuvo
La efectividad de esta tcnica no solo
una banda delgada y no tan visible como las
depende de las etapas (desnaturalizacin,
dems, probablemente por un error cometido
hibridacin y extensin); Sino tambin de
al cargar la muestra en el pozo, antes el
mezcla de reactivos, el rgimen de ciclaje y el
mismo error que se cometi en el grupo 3 y 4
ADN polimerasa. Es necesario que la
que no obtuvieron resultados positivos al
metodologa que se est utilizando tenga un
realizar la electroforesis. Si el ensayo hubiese
equilibrio entre estos parmetros; pues al
tenido como finalidad detectar la presencia de
ajustar condiciones de reaccin parra una
E. coli, se podra asumir que el organismo se
mayor especificidad no siempre es
encuentra en las muestras, debido a que se
compatible lo que puede ocasionar una
registr la amplificacin del gen especfico
reduccin de la eficiencia de esta tcnica o
para este organismo y esto se evidencia en las
que no halla amplificacin del ADN.
bandas registradas sobre la placa de agarosa,
si no hubiese ocurrido la amplificacin del Por otra parte la electroforesis es de gran
gen especifico de E. coli, no hubiese ayuda para la comprobacin de PCR, pues
presencia de bandas sobre la placa de agarosa por medio de ella logramos observar cuantos
y se podra afirmar que no existe presencia pares de bases presenta la amplificacin de
del organismo en las muestras analizadas. DNA en este caso de la Bacteria E. coli.
En nuestro caso (grupo 3) no se evidencio un
corrido de bandas en la electroforesis
probablemente esto se debi a que la
electroforesis depende de la longitud de la
molcula, La cantidad o la concentracin de
DNA; en la muestra la cantidad cargada al gel
eran insuficientes; este error se present al
momento de servir la muestra de DNA en el
poso, no se deposit la cantidad suficiente de
ADN y quedo una pequea cantidad en la
micropipeta aadindosele nuevamente al
poso variando as su volumen y no
sembrando la cantidad estipulada en el
procedimiento de esta manera se afect el
plegamiento de esta.

CONCLUSIN
La PCR es una tcnica muy utilizada en la
biologa molecular, esta se apoya en la
propiedad natural de las ADN polimerasas
para replicar hebras de ADN, por lo que se
aplican ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para realizar la separacin de las
hebras de ADN recin formadas entre s tras
cada fase de replicacin, para que se vuelvan
 CUESTIONARIO

1. Cules son los diferentes tipos o variantes de la tcnica de PCR y describa la diferencia o
modificacin a la tcnica inicial.
R/:

Variante de PCR Diferencia

PCR anidada Utiliza como molde una secuencia de ADN amplificada previamente.
PCR Larga Se emplea un tiempo mayor al de la PCR convencional para amplificar
fragmentos de ADN de entre 5 y 45 Kpb, adicionando una ADN
polimerasa con actividad exonucleasa.
PCR In situ Se realiza la PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin.
PCR Inversa Se emplea para clonar regiones desconocidas de un ADN, situadas en
posicin vecinal a secuencias diana conocidas. Es decir, en lugar de
amplificar la regin interna, flanqueada por los dos cebadores (PCR
convencional), se amplifica la regin externa, que flanquea a los
cebadores.
PCR Asimtrica En esta variante se aaden cantidades muy diferentes de ambos
cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se
agota y, disponibles ya suficientes copias del ADN diana, slo una de
sus hebras sigue amplificndose gracias al cebador ms abundante.
PCR Mltiple Se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello, se
combinan dos o ms pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el
resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes, para
amplificar simultneamente varios segmentos de ADN.
PCR hot start Consiste en privar a la mezcla de reaccin de alguno de sus
componentes (frecuentemente la polimerasa) hasta que se haya
alcanzado una temperatura superior a la de templado. De este modo, se
evita la elongacin de cebadores asociados inicialmente con poco rigor
(a secuencias de homologa parcial con la diana) y, como resultado, se
aumenta mucho la especificidad de la amplificacin.
reacciones PRE-PCR de los
contaminantes potenciales del ADN. Esto
2. En la prctica, la PCR puede fallar por normalmente implica la separacin
varias razones, pero normalmente es espacial de las reas de realizacin de la
debido a su sensibilidad a la PCR de las de anlisis o purificacin de
contaminacin, que a veces provoca la los productos de PCR, y la limpieza
amplificacin de ADN falso. Qu exhaustiva de la superficie de trabajo
tcnicas o procesos se han desarrollado entre la realizacin de una PCR y la
para optimizar la PCR? siguiente, as como la utilizacin de
guantes, tapabocas y gorros al momento
R/: La contaminacin con ADN extrao
de manipular los reactivos, en el proceso
puede solucionarse con protocolos y
de extraccin y en la electroforesis. Las
procedimientos que separen las
tcnicas de diseo de primers son
 importantes en la mejora de la obtencin
de productos de PCR y en evitar la
formacin de productos falsos, y el uso
de componentes alternativos para los
buffers o las enzimas polimerasas pueden
ayudar en la amplificacin de regiones de
ADN largas o, de cualquier otra forma,
problemticas.
3. En qu consiste la PCR en tiempo real
(Q-PCR).
R/: -PCR en tiempo real o PCR
cuantitativa (qPCR): Reaccin de PCR
cuya principal caracterstica es que
permite cuantificar la cantidad de ADN o
ARN presentes en la muestra original, o
para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN
especficas a partir de su temperatura de
fusin tambin denominado valor Tm. Se
puede dividir en las tcnicas basadas en
fluorocromos no especficos y en las
tcnicas basadas en sondas especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos
el ADN, que ve multiplicada su cantidad
con cada ciclo, se une al fluorocromo
(generalmente SYBR Green)
produciendo fluorescencia que es medida
por el termociclador apto para PCR en
tiempo real. Permite cuantificar slo una
secuencia por reaccin pero tiene la
ventaja de utilizar cebadores normales
para su realizacin. Es mucho ms
econmica que la que usa sondas
especficas. Las tcnicas basadas en
sondas especficas utilizan
una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el
cebador directo (forward) y el inverso
(reverse); cuando la sonda est intacta,
presenta una transferencia energtica de
fluorescencia por resonancia (FRET).
Dicha FRET no se produce cuando la
sonda est daada y los dos fluorocromos
estn distantes, producto de la actividad
5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa.
Esto permite monitorizar el cambio del
patrn de fluorescencia y deducir el nivel
de amplificacin del gen.
4. Cules son las principales
aplicaciones en la actualidad de esta
tcnica y en que campos?
R/: La PCR es una de las tcnicas ms
utilizadas de la ingeniera gentica en la
actualidad. Se puede emplear en el
diagnstico, pronstico y tratamiento de
diversas enfermedades sobre todo
oncologas, genes supresores de tumor
que en oncologa van teniendo valor en el
estudio pronstico de ciertos tumores.
Las aplicaciones de la PCR son mltiples,
en la arqueologa, medicina forense,
biotecnologa, taxonoma y la Medicina
clnica, expresin gnica, genotificacin,
deteccin de patgenos y anlisis de
mutaciones.
A. PROBLEMA FORENSE.
DNA de tres sospechosos
El jardinero de la casa
La esposa del empresario
El vicepresidente de la compaa
1. Abdomen mosquito
2. Ala mosquito
3. Victima
4. Jardinero
5. Mujer de la victima
6. Vicepresidente
R/: El asesino es el vicepresidente ya que
el mosquito pudo picar a la vctima y al
sospechoso dentro del coche, esto lo
podemos comprobar el corrido de la
muestra de ADN sometidas a la tcnica
de electroforesis, analizamos que el
corrido nmero 1 y 6 tiene gran similitud
en la muestra y el corrido 1 corresponde
al abdomen del mosquito, lo cual el
asesino tena que tener muestra de DNA
similar a la del abdomen del mosquito,
vemos que es el corrido nmero 6 que
pertenece al DNA del presidente, el cual
sufri la picadura del mosquito mientras
iba en el coche con la vctima.

B. En que est fundamentada una
electroforesis?
R/: La electroforesis es una tcnica para
la separacin de molculas segn la
movilidad de estas en un campo elctrico
a travs de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaos
moleculares y carga elctrica. ste es
exactamente el principio en que se basa la
electroforesis de cidos nucleicos.
Sometidos a un campo elctrico, la carga
neta negativa del ADN y el ARN har que
estos se muevan en direccin al nodo. Si
se fuerza a los cidos nucleicos a
moverse a travs de un gel formado por
una malla tridimensional de un polmero
como la agarosa, la friccin har que las
molculas de mayor tamao migren con
ms lentitud, mientras las de menor
tamao avanzan ms en el gel,
permitiendo que las diferentes molculas
se separen en funcin de su tamao. Del
mismo modo, molculas de ADN o ARN
con topologas o estructuras
tridimensionales diferentes tambin se
comportarn de forma diferente ante la
friccin con la malla del polmero,
permitiendo su separacin.
C. Cules son los mtodos
electroforticos ms usados y en qu
consisten?
R/: La electroforesis de ADN puede
realizarse en geles de agarosa o de
poliacrilamida. Ambos tienen
caractersticas diferentes en cuanto a sus
propiedades y modo de preparacin, por
lo que se utilizar uno u otro en funcin
de la aplicacin y objetivos que
persigamos. La electroforesis en geles de
agarosa es el mtodo estndar para
separar y purificar fragmentos de ADN
cuando no requerimos un alto poder de
resolucin. Por su parte, la electroforesis
en geles de poliacrilamida, aunque tiene
una mayor limitacin en cuanto al tamao
de los fragmentos que podemos separar
(5-600 pb), posee un poder de resolucin
mucho mayor, permitiendo la separacin
de molculas que difieren en un slo par
de bases. Los geles de poliacrilamida se
corren de forma vertical y tienen la
desventaja de ser ms complicados en su
elaboracin y manipulacin. Los geles de
agarosa tienen un poder de resolucin
mucho menor que los de poliacrilamida,
porque no permiten separar molculas de
ADN que difieren en tamao menos de
unas 50 pb. Sin embargo, el rango de
tamaos que pueden separarse es mucho
mayor en un gel de agarosa (molculas
desde 50 pb hasta unas 40 kb)
dependiendo de la concentracin del
mismo (0.3-2% p/v); cuanto ms baja es
la concentracin de agarosa mayor es el
tamao de las molculas que pueden
separarse, y viceversa. Este rango de
tamaos hace a los geles de agarosa
ideales para analizar el producto de
digestiones con enzimas de restriccin, lo
que puede combinarse con otras tcnicas
como el Southern blot, as como para
analizar los productos de una reaccin de
PCR. Los geles de agarosa
convencionales se corren en una cmara
de electroforesis horizontal, con un
campo elctrico uniforme y constante
D. Cules son las principales fuentes
de errores que se cometen al realizar
una electroforesis?
R/: Contaminacin de la muestra: Sea lo
que sea que ests midiendo, el primer
paso para obtener resultados precisos es
una muestra no contaminada. Toma
medidas para evitar la contaminacin
durante la preparacin con el uso de
guantes, utilizando slo envases estriles,
y cambiando la punta de la pipeta
despus de cada uso. Tambin ten
cuidado de no contaminar tu pipeta por
tomar la muestra y hacer que suba hasta
la pipeta.
Preparacin del gel: Muchos errores se
deben a problemas con el gel. En primer
lugar, una concentracin de gel incorrecta
puede hacer que el gel corra demasiado
rpido o no corra en absoluto. Asegrate
de que ests utilizando una concentracin
que est bien medida y orientada hacia
los tamaos generales de la muestra que
se est tratando de medir. El gel puede
verse comprometido de otras maneras.
Antes de cargar las muestras, asegrate
de que el gel no tiene cortes o burbujas.
Incluso una pequea imperfeccin puede
afectar tus resultados. La preparacin
adecuada del gel es la clave. Sigue todas
las instrucciones, vierte lentamente para
evitar la formacin de burbujas, y deja
que el gel se enfre completamente antes
de cargar las muestras. La matriz
molecular del propio gel y la capacidad
de la muestra para correr a travs de esta
matriz al extremo cargado positivamente,
son los que demostrarn el tamao de la
muestra. Un trastorno fsico o incluso una
temperatura demasiado extrema afectarn
esta matriz molecular y pondrn en
peligro la validez de los datos.
Por ltimo, cuando se establece un gel se
coloca un peine para crear los pozos
donde se cargan las muestras. Ten
cuidado de que este peine se coloque
correctamente en los recuadros de la
bandeja, ya que un peine que cree pozos
demasiado profundos o superficiales
puede conducir a errores. El peine no
debe llegar completamente a travs del
gel a la parte inferior de la bandeja, pero
debe crear pozos lo suficientemente
profundos para cargar sus muestras sin
desbordamientos.
Cargas de muestras incorrectas: Aunque
parece bastante simple, cargar tus
muestras en los pocillos pequeos en el
gel puede resultar difcil. Lo ms
importante es asegurarte de que sabes
cunto vas a poner en cada pocillo. El
exceso de la muestra podra causar que
sean manchas grandes o que aparezcan
ms pequeas de lo que realmente son; a
su vez, muy poco de la muestra puede ser
imposible de ver. Adems, no perfores el
gel al cargar las muestras, ya que esto
puede causar problemas, al igual que las
otras imperfecciones de gel.
Problemas en la corriente elctrica: Un
error comn para los nuevos estudiantes
de la tcnica de electroforesis en gel es
correr el gel hacia atrs. Esto sucede
cuando las conexiones positivas y
negativas se unen a los extremos
incorrectos de la bandeja. Se puede evitar
este error recordando que la muestra se
correr siempre al rojo, por lo que
asegrate de que el extremo positivo est
unido en el lado opuesto de la bandeja de
los pocillos de la muestra. Tambin
existen problemas con el uso de un
voltaje incorrecto. Una tensin
demasiado alta puede causar que la
muestra corra al otro extremo del gel tan
rpido que se caiga del mismo, mientras
que una demasiado baja puede significar
que la muestra se tome demasiado tiempo
para correr o no corra lo suficientemente
lejos para ser cuantificada al final. La
colocacin incorrecta de la bandeja con la
corriente o interrupciones en la ltima
pueden causar que la muestra para corra
en diagonal o inconsistentemente, lo que
puede hacer difcil una medicin precisa.
E. Los cidos nucleicos, se pueden
separar por medio de electroforesis en
geles de poliacrilamida?
NO, esta tcnica solo se encarga de
separar estructuras proteicas como lo
podemos observar en la definicin de
electroforesis en geles de poliacrilamida.
La electroforesis de protenas en geles
con una matriz de poliacrilamida,
comnmente denominada electroforesis
en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide
gel electrophoresis') es sin duda alguna
una de las tcnicas ms ampliamente
usada para caracterizar mezclas
complejas de protenas. La electroforesis
en poliacrilamida es un mtodo
conveniente, rpido y econmico a nivel
de muestra pues se requieren slo
cantidades del orden de microgramos de
protena. Estas presentan una carga
elctrica neta si se encuentran en un
medio que tenga un pH diferente al de su
punto isoelctrico y por eso tienen la
propiedad de desplazarse cuando se
someten a un campo elctrico.

REFERENCIAS

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