LA ESPECTROSCOPIA POR INFRARROJO CERCANO (NIRS)

INTRODUCCION

La espectroscopia por infrarrojo cercano (NIRS) es una metodología instrumental que ha

presentado un desarrollo creciente en los últimos años en la industria azucarera mundial. Se la
utiliza tanto en centros de investigación como en diversas industrias, por ser una técnica no
destructiva, rápida, que no emplea reactivos químicos y que requiere menos mano de obra que
los mėtodos tradicionales empleados en el laboratorio. La espectroscopia estudia la interacción
de la radiación electromagnética con la materia. NIRS comprende el segmento de luz de
longitudes de ondas entre 800 y 2600 nm del espectro electromagnético y analiza la absorción
de energía en dicha región por los grupos funcionales de las moléculas de la muestra (ZOSSI,
Silvia; RUIZ, Roberto M 2010).

FUNDAMENTO

La espectroscopia IR se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las moléculas en

vibración. Una molécula absorbera la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha energía
incidente sea igual a la necesaria para que se dé una transición vibracional de la molécula. Es
decir, la molécula comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la energía que se le
suministra mediante luz infrarroja.

Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión. Las

vibraciones de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del eje del enlace
entre dos átomos. Las vibraciones de flexión están originadas por cambios en el ángulo que
forman dos enlaces. En principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella
dactilar), debido a que todas las moléculas (excepto las especies diatónicas homonucleares
como 02 y Br2) tienen algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorción de una
determinada longitud de onda en la zona del espectro electromagnético correspondiente al
infrarrojo.

En la zona del espectro electromagnético IR con longitudes de onda del infrarrojo medio (entre
4000 y 1300 cm-1) se suelen observar una serie de bandas de absorción provocadas por las
vibraciones entre únicamente dos átomos de la molécula. Estas vibraciones derivadas de grupos
que contienen hidrógeno o de grupos con dobles o triples enlaces aislados. (Nakamoto K., 1997).

Carbohidratos

Los espectros de infrarrojo de los carbohidratos Los espectros de los alimentos ricos en
carbohidratos presentan una serie de picos característicos principalmente en la parte derecha
del espectro, sobre todo se puede apreciar un pico muy intenso entre 1000 y 1080 cm-1 . Estos
picos provienen de la vibración en enlaces C-C, C-H, C-O o C-O-C de la molécula del carbohidrato
en cuestión (azúcar, almidón, etc.)

Los picos asociados con los carbohidratos en el espectro se ubican en:

3330 cm-1 , relacionado con la vibración de estiramiento del enlace O-H.

2920 cm-1 , relacionado con la vibración de estiramiento (asimétrica) del enlace C-H.

1150-825 cm-1 , en este intervalo aparecen picos intensos relacionados con diferentes
vibraciones de enlace: C-O (estiramiento), C-H (balanceo) y C-O-C (estiramiento/balanceo).
Comentario: En el espectro es posible observar una zona con una gran cantidad de picos
intensos (1150-825 cm-1), la cual es característica de los carbohidratos, principalmente cuando
se encuentran en polvo, como es el caso de la azúcar de mesa.

Espectro de infrarrojo del azúcar de mesa

Representación del espectro de la molécula de glucosa

Análisis de polisacáridos (determinación de fibra dietética)

La fibra dietética se define como los polisacáridos y lignina que no son digeridos por enzimas
humanas (Lee y Prosky, 1995). Los métodos (AOAC 985-29, 993-21, Horwitz, 2005) se
fundamentan en aislar la fracción de interés con la precipitación selectiva y después determinar
su peso. Una muestra gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimáticamente
con alfa-amilasa, amiloglucosida y proteasa para hidrolizar el almidón y la proteína. El contenido
total de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solución para precipitar
toda la fibra. La solución entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta
como fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985)

Muestras en duplicado de alimentos secos y desgrasados son gelatinizados con a-amilasa

térmicamente estable y luego digerida enzimáticamente con proteasa y amiloglucosidasa para
remover la proteína y el almidón. La fibra dietética soluble es precipitada por la adición de
etanol, el residuo total filtra, se lava, se seca y se pesa. En el residuo en duplicado se determina
proteína, y en el otro cenizo (Official Methods of Analysis. A.O.A.C 199o). Fibra dietética total =
Peso del residuo - Peso (proteína + cenizas).

METODOLOGIA

Correr un blanco a lo largo de toda la determinación.

Pesar por 19 de muestra (exactitud de 0.19) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras no
debe diferir en más de 20 mg. Adicionar 5o ml de buffer de fosfatos o.o8M pH 6 o, Medir pH y
ajustar pH 6+ 0.2 si es necesario.

Adicionar 0,1 mL de la solución de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el
matraz en un baño a ebullición durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con
termómetro que los matraces mantengan 95-100 ° C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente Ajustar a pH 7st 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa
(disolver 50 mg de proteasa en iml de buffer de fosfatos. Adicionar o.1ml de la solución a cada
matraz). Cubrir el matraz con papel aluminio y colocarlos en un baño a 60 ° C por 30 minutos
con agitación continua.

Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 10 mL de HCL 0.325N. Ajustar el pH a 4.0- 4.6,

adicionar o.1mL de amiloglucosidasa, incubar a 60 ° C por 30 minutos con agitación continua.
Adicionar 280 mL de etanol g5% precalentado a 60 ° C (medir el volumen antes de calentar).
Dejar en reposo 1 h. Pesar el crisol conteniendo la celita, humedecer y redistribuir la cama de
celita con etanol 789%. Aplicar succión.

Mantener la succión y cuantitativamente transferir el precipitado de la digestión enzimática.

Lavar el residuo con 3 porciones de 20 mL de etanol 7896, lavar con 2 porciones de 10 mL de
etanol 95%, lavar con 2 porciones de 10 mL de acetona, si se forma una forma una goma, mover
con la espátula para mejorar la filtración

Secar el crisol conteniendo el residuo toda la noche a 70 ° C.

Enfriar en desecador y pesar

Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo

RESULTADOS

Cálculo de fibra dietética total:

% FDT ¿ ¿ x 100
Donde:

m = masa de la muestra = promedio de la masa de 2 muestras (mg).

mi = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado
(mg).

P y C = masa (mg) de proteina y cenizas, respectivamente en los residuos de las muestras.