UNIVERSIDAD ESTATAL DE MILAGRO

FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERÍA

CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
Materia
“Técnica instrumental”
Docente:

BARZALLO GRANIZO DIEGO GEOVANNY

Nombre:
Manuel E Urrieta Pazmiño

Tema:

ULTRACENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA Y
ANALÍTICA

NIVEL - PARALELO
Bio-c1

Fecha
27/02/2022
 INTRODUCCION

El bioquímico sueco Svedberg inventó la ultracentrífuga en 1923. Alcanza velocidades de hasta 80.000 rpm
creando un campo magnético Gira sobre 600.000 gramos. Ocurriendo una ultracentrifugación de
Separación de proteínas, ácidos nucleicos y gránulos subcelulares.
La velocidad a la que una partícula sedimenta en la ultracentrífugación está relacionada con su masa. La
fuerza, F (sedimentación), que actúa para sedimentar una partícula de masa m, que está situada a una
distancia r del centro alrededor del cual se halla girando con velocidad angular ω (en rad • s), es la fuerza
centrífuga (m ω2 w r) sobre la partícula menos la fuerza de flotación (Vω r) ejercida por la disolución:
F = mω2 r - Vω r
ULTRACENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA
Se trata de aislar material biológico para su posterior estudio Bioquímica. El rotor preparado contiene un
tubo de muestra cilíndrico, Su eje puede ser paralelo, oblicuo o perpendicular al eje.
rotor giratorio.
ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA
Se diferencia de los preparados en que se utiliza principalmente para la investigación propiedades de
deposición de macromoléculas y estructuras biológicas. Por tanto, se extraen conclusiones en cuanto a los
parámetros fisicoquímicos descritos.
Utilice un rotor especial. Más comúnmente utilizado en el laboratorio. La bioquímica es la identificación de
macromoléculas (proteínas y principalmente ácidos nucleicos) utilizándose tres métodos:
• El de velocidad de sedimentación
• El de equilibrio de sedimentación
• El de la aproximación al equilibrio de sedimentación
DESARROLLO

1 Aplicaciones de la Ultracentrifugación en Purificación y Caracterización de Biomoléculas

Ultracentrifugación preparativa

Ultracentrifugación diferencial

1. Las partículas se separan en función de su tamaño y masa (coeficiente de sedimentación, S).

2. Se pueden usar múltiples pasos de granulación para el enriquecimiento iterativo.
3. Ideal para separar grupos de partículas de tamaños muy diferentes.

Ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC)

1. Las partículas solubles se separan en una columna líquida de densidad variable (gradiente de
densidad).
2. En los experimentos zonales de tasas, los artículos p migran a tasas variables, dictadas por sus
valores S, y dependen del tiempo.
3. Las separaciones isopícnicas son insensibles al tiempo, donde las partículas migran a su aparente
densidad flotante en el gradiente.
4. Ideal para la separación de alta resolución de materiales pequeños con propiedades físicas
similares.
Rotor y óptica AUC

• Los rotores de 4 y 8 orificios están clasificados para 60 000 y 50 000 rpm, respectivamente.
• La interferencia y la óptica de longitud de onda múltiple se pueden utilizar en tándem.

Componentes de una celda AUC

• Pieza central de dos sectores intercalada entre dos ventanas de cuarzo o zafiro y ensamblada en
una carcasa cilíndrica.
• Se aprieta un anillo roscado para sellar la celda.
• Es necesario un contrapeso.

Rotor y óptica AUC

• Los rotores de 4 y 8 orificios están clasificados para 60 000 y 50 000 rpm, respectivamente.
• La interferencia y la óptica de longitud de onda múltiple se pueden utilizar en tándem.
Introducción a los datos de velocidad de sedimentación

La migración de muestras produce límites móviles que contienen información de sedimentación y difusión.

ESTUDIO DE CASO DE FLUJO DE TRABAJO AUC CON INSULINA

Comparación de ProteomeLab vs Optima AUC

2 Caracterización de proantocianidinas de lúpulo de alto peso molecular mediante ultracentrifugación
analítica
Las moléculas polifenólicas están ampliamente distribuidas en el reino vegetal y, por lo tanto, representan
una parte importante de la dieta humana. Estudios recientes han demostrado su impacto beneficioso en
algunas condiciones de salud, como infecciones del tracto urinario y cistitis . Entre los polifenoles, las
proantocianidinas (también conocidas como taninos condensados) a menudo se asocian con estos
beneficios.

Los métodos cromatográficos están limitados en términos de análisis preciso del peso molecular debido a
la ausencia de estándares de calibración apropiados . Por lo tanto, existe la necesidad de una metodología
mejorada para el análisis de polímeros de proantocianidina grandes, particularmente aquellas especies con
DP >4. Las metodologías analíticas mejoradas ayudarán a aumentar nuestra comprensión de las funciones
biológicas de estos compuestos complejos.

Materiales

Muestras de lúpulo

Se compraron dos variedades de lúpulo (Magnum, Saaz) de Hop Shop (Plymouth, Reino Unido), como
conos secos enteros. Barth Innovations Ltd. (Tonbridge, Reino Unido) proporcionó amablemente otras dos
muestras de lúpulo Saaz, como gránulos y conos enteros secos (Saaz 2).

Las cervezas para los ensayos de clarificación se prepararon utilizando el kit de elaboración casera Young's
Harvest Pilsner Lager, junto con extracto seco de malta ligera (The Hop Shop, Plymouth, Reino Unido) y
azúcar granulada (supermercado Sainsbury's, Nottingham, Reino Unido). La fermentación fue con levadura
Nottingham ale (Lallemand).

Acetona, acetato de etilo, metanol, ácido clorhídrico, n-butanol, sulfato de amonio férrico se adquirieron
de Sigma Aldrich (Dorset, Reino Unido). Se utilizó agua Milli-Q (>18 MΩ/cm) en el método de
fraccionamiento de extracción en fase sólida (SPE).
Métodos

Extracción

El lúpulo se molió utilizando un molino de laboratorio Perten 3600 (Hägersten, Suecia). A continuación, se
mezcló polvo de lúpulo (10 g) con 100 ml de acetona/agua (proporción variable, v/v) en una tabla de
rodillos Thermo Denley Spiramix (Loughborough, Reino Unido) durante 15 min y, posteriormente, se filtró
a través de papel de filtro Whatman No1. . La acetona se evaporó utilizando un evaporador rotatorio Buchi
R-II (Flawil, Switerland) a 45 °C. Luego, el extracto se enfrió durante la noche a 4 °C, antes de la
centrifugación a 4000 rpm usando una centrífuga Thermo Jouan CR3i (Loughborough, Reino Unido)
durante 10 min y el residuo se descartó.

Ensayo de ácido butanol para el contenido de proantocianidinas

Se preparó una solución de butanol ácido a partir de 95 mL de n-butanol con la adición de 5 mL de HCl
concentrado. Se preparó sulfato de amonio férrico al 2% (FeNH 4 (SO 4 ) 2 · 12 H 2 O) añadiendo 1 g de
sulfato de amonio férrico a 50 ml de HCl 2 N. Para cada ensayo, se combinó el reactivo ácido butanol (3
mL) con 25 µL de la muestra de extracto de lúpulo y 100 µL de la solución de reactivo de hierro en un tubo
de vidrio con tapa roscada. Los tubos se calentaron a 90 °C durante 30 min

Ensayo de clarificación de cerveza

Una vez que la cerveza había sido trasvasada y enfriada a 4 °C, se llenaron 500 ml de cerveza en un vaso de
precipitados de 600 ml. Se introdujo extracto de lúpulo (4 ml/l) en cada vaso de precipitados y se mezcló el
contenido usando un agitador de paletas superior IKA OST20 de línea amarilla a 500 rpm durante 30
segundos. Después de mezclar, el contenido del vaso de precipitados se transfirió a conos Imhoff
graduados de policarbonato individuales de 1 L (Nalgene: tamaño de cierre de 13 mm, 106 mm de
diámetro). La profundidad del sedimento se registró 2 h y 24 h después de la clarificación. La turbidez de la
cerveza (dispersión de 25° y 90°) se midió con un medidor de turbidez (Haffmans Vos Rota 90/25; Pentair,
Alemania) a 4 °C 24 h después de la clarificación y después de centrifugar las muestras a 500 rpm durante
15 min para eliminar los residuos. levadura.

Ultracentrifugación analítica (AUCF), análisis de velocidad de sedimentación

Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron utilizando una ultracentrífuga analítica

Optima XL-I (Beckman, Palo Alto, EE. UU.) que emplea la óptica de interferencia de Rayleigh. Las fracciones
metanólicas del extracto de lúpulo a una dilución de 6, 10, 12 o 24 veces (395 µl de muestra y 405 µL de
metanol de referencia) se inyectaron en celdas de titanio de doble sector de 12 mm con ventanas de
zafiro. La dilución de 6 veces se realizó dos veces en cada experimento AUCF. Las células se cargaron en el
rotor que se hizo girar a 45000 rpm (20,0 °C). Se tomaron escaneos a intervalos de 5 min para una
adquisición de 200 escaneos como mínimo para cada celda.

Equilibrio de sedimentación

Los experimentos de equilibrio de sedimentación se realizaron utilizando la ultracentrífuga analítica

Beckman (Palo Alto, EE. UU.) Optima XL-I y el sistema de interferencia de Rayleigh. Se llenaron celdas de
titanio de doble sector de 20,0 mm de paso óptico con ventanas de zafiro con 140 µl de extracto de lúpulo
a una dilución de 40 veces (sector de muestra) y 140 µL de disolvente de referencia (metanol) en la celda
de sector de referencia. Los experimentos se realizaron comenzando con una velocidad centrífuga baja de
20000 rpm antes de pasar a velocidades más altas.

Procesamiento de datos AUCF

Los datos experimentales de la velocidad de sedimentación se analizaron en el algoritmo SEDFIT de

Schuck usando el procesamiento c(s) y se expresaron usando la distribución del coeficiente de
sedimentación c(s) vs s donde s es el coeficiente de sedimentación en unidades Svedberg (S = 10 −13 seg).

Resultados

La extracción de proantocianidinas (PA) del material de lúpulo utilizando diferentes proporciones de

acetona en agua produjo una serie de extractos. Estos fueron analizados por su contenido de
proantocianidina utilizando el ensayo de butanol ácido. La hidrólisis de proantocianidinas en estas
condiciones produce antocianidinas que se midieron en un espectrofotómetro por absorbancia a 550 nm.

Figura 1

La extracción de lúpulo con 70 % de

acetona (aq) produjo el nivel más alto de proantocianidinas. clarificación en cerveza verde .
Tabla 1 Actividad de floculación y resultados de turbidez de cerveza verde clarificada (4 °C) usando
extractos de diferentes extracciones con solventes a 4 mL/L.

% de extracto de Altura del Medición de

acetona (aq) sedimento (mL) turbidez

2 horas 24 horas H90 H25

0 6.25 6 17.3 27.8

10 6 6 12.7 21.7

20 6.25 6 15.7 25.7

30 6.25 6.5 12.2 20.2

40 6.5 6.5 10.4 18.3

50 6.5 6.25 10.4 18.1

60 6.5 6.5 10.9 19.3

70 6.5 7.25 9.4 17.3

80 6 6 10.9 19.0

90 6 7.25 12.1 21,9

100 6.25 7.5 18.0 28.8

1. El análisis de turbidez se realizó después de 24 h de clarificación.

2. H90 = dispersión de 90°; H25 = dispersión de 25°;
 3 Ultracentrifugación analítica (AUC): descripción general de la aplicación de fluorescencia y

absorbancia AUC al estudio de macromoléculas biológicas

Se han logrado avances significativos en las capacidades de ultracentrifugación analítica (AUC) en las
últimas dos décadas a través del desarrollo de nuevos sistemas ópticos y métodos de análisis. Sin embargo,
esta técnica, que históricamente ha sido el “estándar de oro” para la caracterización de macromoléculas y
complejos biológicos en solución, generalmente no es muy bien entendida ni utilizada comúnmente en los
campos de la bioquímica y la biología molecular.

Debido a que Aviv Biomedical, Inc. ha cesado la producción del FDS para los sistemas Beckman XL-A/XL-I, a
partir de ahora no existe en el mercado ninguna opción de fluorescencia para SV-AUC. Aunque la oferta
actual de Beckman, Optima AUC, cuenta con avances en la recopilación y resolución de datos en relación
con los sistemas XL-A/XL-I, la óptica de fluorescencia aún está en desarrollo. Nuestra esperanza es que
enfatizar la fuerza del SV-AUC detectado por fluorescencia ayudará a impulsar el avance continuo de los
sistemas ópticos para la nueva generación de instrumentos.

Velocidad del rotor

La velocidad apropiada del rotor y el número de escaneos a recolectar son una función no solo de la masa
de la partícula de interés sino también de sus características de difusión, el tiempo entre escaneos para
cada muestra y la heterogeneidad de la muestra (es decir, la concentración parcial de partículas no
unidas). componentes). No existe una relación simple entre la masa de partículas y la velocidad ideal del
rotor. Tanto UltraScan como SEDFIT tienen herramientas para simular datos de sedimentación de
partículas de masa y forma variables.

Sistema óptico

La elección ideal de los sistemas ópticos AUC varía según el contenido de la solución y la concentración de
la partícula de interés. La óptica de absorbancia tiene un límite inferior de ~0,1 de densidad óptica (DO)
debido a la baja relación señal-ruido y, por lo general, no debe usarse por encima de 1 DO en ninguna
longitud de onda debido a la no linealidad de la señal de absorbancia.

Volumen Específico Parcial ( )

En un experimento AUC, determinar con precisión el volumen específico parcial, es decir, el volumen de
solvente desplazado por una partícula, es un componente crucial para extraer el peso molecular, como se
ve en la ecuación de Svedberg. Debe enfatizarse que el análisis SV busca describir el comportamiento de
sedimentación y difusión observado experimentalmente ajustando s y f/f 0 (relacionado con el coeficiente
de difusión, f/f 0 es la relación entre el coeficiente de fricción f y el coeficiente de fricción de un teórico
). esfera de la misma masa y , f 0 ).

Especies formadoras de gradientes

Dado su uso común en tampones como agente protector de proteínas y ADN, es fundamental tener en
cuenta la contribución a la densidad de la solución de aditivos como el glicerol o los agentes de
hacinamiento. Los gradientes de densidad cambiarán significativamente la interacción de una partícula de
sedimentación con la solución circundante, reduciendo el coeficiente de sedimentación aparente.

Figura 1
Los componentes del tampón de sedimentación conjunta deben corregirse en el análisis SV-
AUC. Distribuciones de coeficientes de sedimentación integrales G(s) de un experimento SV-AUC de
absorbancia de 260 nm con nucleosomas ensamblados a partir de ADN de 147 pb e histonas de X. laevis en
tampón que contiene ( A ) 0,1 %, ( B ) 0,5 % o ( C ) 1% de glicerol en peso. El análisis de vHW se realizó con
o sin inclusión de la contribución de glicerol a la densidad del disolvente ρ. ( D ) El análisis con aporte de
glicerol incluido en todos los tampones de muestra corrige con precisión los cambios en la tasa de
sedimentación.
Detergentes y Proteínas Portadoras

Las proteínas "pegajosas" y otras macromoléculas que se adhieren a las superficies son problemáticas para
los métodos biológicos in vitro.

Figura 2
Los detergentes tampón pueden salvar los problemas de solubilidad de las partículas, con un efecto
insignificante en la sedimentación observada.
( A ) Distribuciones G(s) de un experimento SV-AUC-FDS con Spn1 marcada con Alexa488, una proteína de
49 kDa con un núcleo globular y regiones N- y C-terminales intrínsecamente desordenadas que
comprenden aproximadamente la mitad de la masa total.
( B ) Datos sin procesar recopilados de una ejecución de SV-AUC-FDS con Spn1 marcado con Alexa488
combinado con una cantidad equimolar de dímero de histona H3-H4 en un tampón que contiene Tris 20
mM (pH 7,5) y NaCl 150 mM.
( C ) Datos sin procesar recopilados de la misma serie SV-AUC-FDS descrita en (B) de una muestra que
contiene Spn1 marcado con Alexa488 combinado con una cantidad equimolar de dímero de histona H3-H4
en un tampón que contiene Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM y 0,1% CHAPS.
 Spn1 Spn1 (0,1% CHAP)

S 20, W 2,57 (0,34) a 2,56 (0,36)

f/f 0 1,99 (0,56) 2,00 (1,14)

M (Da) 53.107 (31.332) 52.501 (31.574)

Marcado fluorescente de macromoléculas

Los fluoróforos con un máximo de excitación de 488 nm proporcionan la mejor señal con los instrumentos
Aviv FDS actuales porque esta longitud de onda coincide con el láser de excitación FDS. Se pueden usar
tintes con rangos de excitación que se desvían de 488 nm, pero requerirán concentraciones finales más
altas para producir una señal equivalente a la de los tintes con excitación máxima a 488 nm. El marcaje
fluorescente extrínseco de proteínas puede lograrse mediante la conjugación de cadenas laterales de
aminoácidos nativos (p. ej., ácidos carboxílicos, cisteínas) con fluoróforos funcionalizados; sin embargo,
encontramos que esto a menudo conduce a problemas con el plegamiento de proteínas, la funcionalidad o
las interacciones macromoleculares.

CONCLUSION

Hasta la fecha, la ultracentrifugación se ha utilizado de forma rutinaria en una variedad de formas y

procesos, y sigue siendo un método predominante no solo en la investigación académica sino
también en entornos industriales y médicos. Sin embargo, se debe prestar atención al uso adecuado
de la centrífuga de ultra alta velocidad para garantizar la seguridad de la muestra y del usuario del
dispositivo, así como para garantizar la funcionalidad a largo plazo.

La ultracentrifugación analítica (AUC) es un método informativo ampliamente utilizado para

estudiar características macromoleculares como el tamaño, la forma, las mediciones en capas y las
propiedades de unión faltantes en un entorno práctico de estado de solución en la mayoría de los
sistemas desarrollados. Método ortogonal. Sin embargo, AUC permanece sin explorar en cuanto a
sus capacidades y potencial en bioquímica y biología molecular. A pesar del rápido crecimiento de
la potencia informática y las herramientas de análisis AUC durante este milenio, ha habido poco
progreso en el desarrollo de nuevas aplicaciones para esta tecnología. haciendo que estas poderosas
herramientas sean infravaloradas e infrautilizadas en muchas instituciones de investigación.
 Bibliografía
Applications of Ultracentrifugation in Purification and Characterization of Biomolecules -

Beckman Coulter. (2019, 18 julio). Beckman Coulter: Life Sciences.

https://www.beckman.com/resources/reading-material/posters/applications-of-

ultracentrifugation-in-purification-of-biomolecules

Edwards, G. B., Muthurajan, U. M., Bowerman, S., & Luger, K. (2020). Analytical

Ultracentrifugation (AUC): An Overview of the Application of Fluorescence and

Absorbance AUC to the Study of Biological Macromolecules. Current Protocols in

Molecular Biology, 133(1). https://doi.org/10.1002/cpmb.131

Gadon, A. (2019, 2 septiembre). Characterisation of high molecular weight hop proanthocyanidins

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