ESPECTROFOTOMETRÍA Y

COLORIMETRÍA
ESPECTROFOTOMETRÍA

 La espectrofotometría de absorción es la medición

de la capacidad que tienen ciertas sustancias de
absorber un haz de luz a determinada longitud de
onda de la banda espectral.

 La longitud de onda se mede en nanómetro.

DIVISIÓN DE LA BANDA ESPECTRAL
LONGITUD DE ONDA
BANDA ESPECTRAL
(en nanómetros)
UV-vacío 100-200
UV 200-400
Visible 400-700
IR-próximo 700-2000
IR 2000-10000
IR-lejano 10000-40000
TIPOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA
 Espectrofotometría UV/visible
 Espectrofotometría de Fluorescencia,
Fosforescencia y Quimioluminicencia molecular
 Espectrofotometría atómica basada en la
atomización con llama electrotérmica
 Espectrofotometría de Emisión basada en la
atomización con plasma arco y chispa
 Espectrofotometría de Resonancia Magnética
Nuclear
 Espectrofotometría de Rayos X

 Espectrofotometría de Absorción en el Infrarrojo

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
 Transmitancia: Es la fracción de la radiación
incidente transmitida por la solución absorbente

 Absorbancia: La absorbancia de una solución

aumenta cuanto mayor es la atenuación de haz
de luz.

 La transmitancia y la absorbancia son

inversamente proporcionales.
ABSORCIÓN DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
O VISIBLE

 La absorción de radiación ultravioleta o visible

proviene de la excitación de los electrones
enlazantes. Los electrones que contribuyen a la
absorción por una molécula orgánica son aquellos
que participan directamente en la formación del
enlace entre átomos y que están además
asociados a más de un átomo y los electrones no
enlazantes o externos que no participan y que
están localizados alrededor de átomos como el
oxígeno, los halógenos, el azufre y el nitrógeno.
COMPONENTES DE LOS ESPECTROS UV/VIS
 Fuente
 Selector de longitud de onda

 Recipientes de muestra

 Detectores de radiación

 Sistemas de procesamiento y dispositivos de

lecturas de señales
TIPOS DE LÁMPARA EN UV/VIS
 Lámparas de deuterio e hidrógeno: la excitación
eléctrica de estos elementos a baja presión
producen un auténtico espectro continuo en la
región UV, este espectro es utilizable en la región
de 160 a 375nm a longitudes de onda mayores
produce unas líneas de emisión que hacen una
interferencia.

 Lámparas de filamento de tungsteno: es la

lámpara más común de radiación visible y del
infrarrojo cercano, esta lámpara es útil a una
longitud de onda comprendida entre los 350 y
600nm.
ESPECTROMETRÍA IR
 Las mediciones espectrofotométricas en la zona
del infrarrojo se utilizan principalmente como
pruebas de identificación y no de cuantificación.
El espectro infrarrojo es único para cada especie
química, con la excepción de los isómeros ópticos.

 Tipos
 Cercano
 Medio
 Lejano
TIPOS DE VIBRACIÓN MOLÉCULAR
 Pueden distinguirse dos tipos
básicos de vibraciones: de
tensión y flexión.
 Una vibración de tensión supone
un cambio continuo en la
distancia interatómica a lo largo
del eje del enlace entre dos
átomos.
 Las vibraciones de flexión se
caracterizan por un cambio en el
ángulo entre dos enlaces y son de
cuatro tipos: de balanceo, de
aleteo, de torsión y tijereteo.
EJERCICIO
 Al realizar un estudio de colorimetría se tenía
una muestra de suero de sangre, se desea
determinar la cantidad de ASA de la cual se
tomaron 0.2ml y se llevo a un volumen final de
5mL, al realizar la lectura presento un
absorbancia de 0.59560. La curva del estándar
presento los siguientes datos.
ppm Aborbancia
2 0.0871
5 0.25356
8 0.40484
11 0.53845
14 0.72492
17 0.84119
20 0.9971
1ER PASO CURVA
Curva de Estándar
1.2

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
0 5 10 15
y = 0.0503x
20
- 0.0037
25
Concentración (ppm)
R² = 0.9984
2DO PASO
 Determinar la concentración en base a la
ecuación de la recta

X = (0.59560 + 0.003)/ 0.050

X = 11.972
3ER PASO
 Determinar la concentración de la solución madre

C1 V1 = C2 V2

C1 = (11.972ppm * 5ml) / 0.2ml

C1 =299.3
3ER PASO
 Determinar la concentración de la solución madre

C1 V1 = C2 V2

C1 = (11.972ppm * 5ml) / 0.2ml

C1 =299.3
OBSERVAR ESTOS VIDEOS

 https://youtu.be/fXjP10sdmQU
 https://youtu.be/i_3wweyhZpg
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
 PRÁCTICA No. 6
Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas.
Niveles de Organización de Proteínas

Introducción

Los aminoácidos son moléculas químicas que poseen propiedades específicas de

acuerdo a su estructura. Los aminoácidos tienen por lo menos un grupo ácido a la vez que
poseen por lo menos un grupo básico. Esta propiedad característica de los compuestos
anfóteros permite que los aminoácidos jueguen papeles importantes dentro del metabolismo
del ser humano. Una de ellas es su polimerización para la formación de proteínas, quienes
gracias a las estructuras variantes de los aminoácidos, tienen formas tridimensionales
específicas. En el mundo de las proteínas, la función de cada una de ellas depende
enteramente de esta estructura tridimensional específica. En la presente práctica se
pretende establecer los principales métodos de identificación de aminoácidos y proteínas.
Para lograrlo, se determinará si existe la presencia de aminoácidos y/o proteínas en
cantidades detectables en una serie de artículos alimenticios y caseros.

Los aminoácidos son compuestos orgánicos que tienen la característica de poseer

tanto grupos ácidos (grupos carboxilo, --COOH) como grupos básicos (grupo amonio, --
NH2). En el organismo, los aminoácidos forman parte de las proteínas, todos ellos en su
forma alfa-aminoácido.

Los aminoácidos como tales son un requerimiento dietético de gran importancia del
ser humano, ya que se utilizan en la síntesis y mantenimiento de proteínas en el organismo.
La mayor fuente de aminoácidos en la dieta son las proteínas mismas, sin importar su
fuente. Sin embargo, hay una serie de aminoácidos que no pueden sintetizarse en el
organismo y que por lo tanto es necesario obtener a través de la dieta. Estos aminoácidos
son conocidos como aminoácidos esenciales.

El ser humano no tiene un requerimiento dietético de proteína en sí como tal. El

requerimiento dietético del ser humano es por los aminoácidos y su principal fuente son las
proteínas, tanto de fuente animal como vegetal. La calidad de una proteína se determina por
medio del contenido de aminoácidos esenciales que contenga. Para los infantes, los
aminoácidos esenciales deberían formar un 43% del total de aminoácidos ingeridos,
mientras que para los niños de 10 a 12 años, deberían formar un 36% y para los adultos,
solamente el 10%. Es importante ingerir proteínas de alta calidad no solamente como parte
de una dieta sana regular, sino de manera especial durante los períodos fisiológicos de alto
estrés, tales como fiebre, quemaduras, trauma quirúrgico, fracturas y otros estados
similares. Por otro lado, es necesario restringir la fuente proteica en casos de enfermedad
aguda del hígado y enfermedades renales avanzadas.

Los péptidos y las proteínas se forman a partir de la polimerización de L- -

aminoácidos a través de la formación de enlaces peptídicos. El enlace peptídico es la unión
del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino del siguiente aminoácido.
 Las proteínas poseen cuatro niveles de estructura:

• Primaria: Secuencia lineal de aminoácidos

• Secundaria: Arreglo de la cadena de aminoácidos que forman la proteínas.
Puede formarse un alfa-hélice, una hoja beta o una curva beta
• Terciaria: Arreglo tridimensional de las estructuras de las estructuras alfa
hélice, una hoja beta o una curva beta
• Cuaternaria: Asociación no covalente de una, dos o más subunidades de
proteína (en caso de una sola, se conoce como proteínas monomérica, que
no se asocia con ninguna otra subunidad).

OBJETIVOS:

Que el estudiante:

1. Conozca las propiedades que la estructura química confiere a los aminoácidos y

a las proteínas.
2. Identifique soluciones que contiene aminoácidos libre y proteínas
3. Conozca aquellos artículos alimenticios o caseros que contienen aminoácidos y
proteínas.
4. Conozca la diferencia entre pruebas cualitativas de cuantitativas.

MATERIALES:

• Reactivos:
1. Soluciones de varios artículos o sustancia caseras, proporcionadas por le
estudiante.
2. Solución de ninhidrina, 0.35 % p/v en etanol
3. Reactivo de biuret
• Cristalería:
1. Pipetas volumétricas de 5 mL
2. Tubos de ensayo
• Instrumentación:
1. Micropipetas o goteros
2. Gradilla para tubos de ensayo

PROCEDIMIENTO:

1. Determinación de aminoácidos:
a. En su gradilla, coloque 12 tubos de ensayo y numérelos claramente. Coloque
en cada uno de ellos alrededor de 2 mL de las soluciones siguientes:

Muestra Solución
 1 Agua
2 Clara de huevo diluída
3 Yema de huevo diluída
4 Sustituto de azúcar (especificar en sus anotaciones cuál se utilizó)
5 Extracto de papa
6 Solución de Maicena
7 Caldo de espinacas
8 Jugo de carne
9 Jugo de carne con piña

b. A cada uno de los tubos, agregue cuatro gotas de solución de ninhidrina,

agite por unos momentos y déjelo reposar durante unos minutos. Anote
cualquier cambio de color.
c.
2. Determinación de proteínas:
a. A otro grupos de tubos de ensayo claramente identificados con la misma serie
de muestras agregue cuatro gotas de reactivo de Biuret, Agite por unos
momentos y déjelo reposar durante unos minutos.
b. Anote cualquier cambio de color.

REPORTE:

• Recuerde que en esta práctica se está llevando a cabo únicamente una

determinación cualitativa, y no cuantitativa. Sin embargo, al anotar los resultados de
estas pruebas, diferencie según la intensidad de cambio de color usando un número
diferente de signos positivos. Por ejemplo, si nota un cambio leve de color, use un
símbolo (+); si el cambio es más que leve, use dos (++); si es notorio, use tres (+++);
y si es dramático, use cuatro (++++).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Kaplan, L.A. y A.J. Pesce, S.C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry. Theory,
Análisis, Correlation. 4ª. Edición. Mosby, Inc. Pp. 698
2. Burtis, C.A. y E. R. Ashwood, 2001. Fundamentals of Clinical Chemistry. 5ª. Edición,
W.B. Saunders Company. Pp. 300-305
3. Murria, R., Mayes, P., Granner, D., Rodwell, V. 2001. Bioquímica de Harper. 15ª.
Edición en español, traducida de la 25ª Edición en inglés.
REFERENCIAS EGRÁFICAS:
1. Sun Wang, Nam. Department of Chemical Engineering, University of Maryland.
Amino Acid Assay

POST-LABORATORIO: (reporte)

1. Aminoácidos:
a. Investigue el mecanismo de la reacción de ninhidrina
b. ¿Qué color espera obtener en una prueba positiva de aminoácidos?
2. Proteínas:
a. Investigue el mecanismo de la reacción de Biuret. ¿qué contiene el
reactivo y cómo reacciona con las proteínas?
b. ¿Qué color espera obtener en una prueba positiva de proteínas?
3. Diferencie un método cualitativo de un cuantitativo
4. Realice una ficha informativa donde se muestre lo siguiente tanto del biuret como
la ninhidrina, en donde se vea su molécula y como da el color positivo.
5. Describa claramente los cuatro niveles de organización de una proteína.
 PRACTICA No.5

Determinación de la actividad enzimática de la Bromelina en sustratos proteicos.

https://youtu.be/7t7v8w7EqTM

INTRODUCCION:

La bromelina es un complejo enzimático digestivo que contiene azufre y se extrae del tallo y de la
fruta de la planta de piña, “Ananas comosus”, familia de las Bromeliáceas. Destaca por su actividad
proteolítica, es decir, ayuda a digerir las proteínas descomponiéndolas en aminoácidos.

Las proteasas son enzimas proteolíticas que cumplen una importante función en el desarrollo de las
reacciones inherentes al metabolismo de la planta y existen varios estudios desarrollados que
demuestran que las proteasas, desempeñan un rol muy importante en la fisiopatología de muchas
enfermedades. Se ha despertado en su estudio, tanto en lo concerniente a su actividad enzimática,
su efecto sobre distintos sustratos y también en lo relacionado a sus inhibidores. Las proteasas
constituyen una muy larga y compleja agrupación de enzimas usadas para transformar proteínas en
simples péptidos.

La piña contiene diversas enzimas entre las que se destacan las proteasas, sobresaliendo la
bromelina que es una glicoproteína básica del grupo de las cistein proteasas. Es una proteína
constituida por aminoácidos que se encuentran enrollados en dos partes separadas por un puente
tiene un lugar activo con un grupo tiol (SH) libre, la misma que ha reportado usos variados.

Bromelina

Materiales y procedimiento

• Un paquete de gelatina (de sabores o sin sabor)

• Agua
• Recipiente para mezclar, cuchara, taza para medir, palillo de dientes, rotulador, seis tazas
pequeñas
 • Ablandador de carne
• Piña fresca
• Piña en conserva
• Horno microondas
• Refrigerador (con congelador).
• Se etiquetan las tazas con los números del 1 al 6.

Se prepare la gelatina según las instrucciones del paquete.

Se divide la gelatina en seis porciones en las correspondientes seis tazas etiquetadas, dejando que
solidifique en el refrigerador o en el congelador para acelerar el proceso.

Cuando la gelatina esté cuajada, sacar las tazas del refrigerador y dejar que alcancen la temperatura
ambiente (que debería ser menor de 20 grados).

Se extraen de una pieza de piña fresca tres trozos aproximadamente cúbicos de unos 2,5 cm de
lado. Uno de ellos se deja a temperatura ambiente (menor de 20 grados); otro se pone en el
congelador durante 30 minutos y el tercero se pone en un microondas a toda potencia durante un
minuto. Después se deja que estos dos últimos trozos vuelvan a tener la temperatura ambiente
(menor de 20 grados).

Colocar lo siguiente sobre la superficie de la gelatina en cada una de las tazas:

nada (servirá de control)

espolvorear una cucharada de ablandador de carne

el trozo de piña fresca que no tuvo ningún tratamiento

el trozo de piña que se congeló

el trozo de piña que fue calentado en el microondas

un trozo de piña en conserva (en lata, frasco…)

Examinar las tazas cada cinco minutos, echando a un lado los trozos con un palillo de dientes para
observar su efecto sobre la gelatina (volver luego la pieza a su posición original). Registrar las
observaciones.

Después de 15 minutos (tres conjuntos de observaciones), meter las tazas en el refrigerador para
hacer una observación final una hora o dos más tarde, o incluso al día siguiente.

Se observará que en las tazas que contienen ablandador de carne, piña fresca y piña congelada, la
superficie de gelatina es acuosa; incluso la piña podrá hundirse en la gelatina. Sin embargo, en las
tazas que contienen solo gelatina y gelatina con piña enlatada y piña tratada en el microondas, la
superficie de gelatina permanece firme.
Bibliografía

1. Jacobsen, Erica. Soup or Salad? Investigating the Action of Enzymes in Fruit on Gelatin.
Journal of Chemical Education 1999, 76, 624A. DOI: 10.1021/ed076p624A.
2. Helmenstine, Anne Marie. The Science Behind Why Pineapple Ruins
Gelatin. ThoughtCo 2018. https://thoughtco.com/why-does-pineapple-ruin-jell-o-
607430 (vista en noviembre de 2018).
3. Gavira Vallejo, José Mª; Paredes Roibás, Denís. Química insólita. Certificado de Formación
del Profesorado (Cursos de Formación Permanente de la UNED); Dpto. Ciencias y Técnicas
Fisicoquímicas, 2018.
 PRACTICA No.4
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA

Introducción:

Las reacciones químicas que se dan en los seres vivos no podrían tener lugar sin la presencia de
los enzimas. Estas macromoléculas, que generalmente son proteínas, catalizan las reacciones
bioquímicas, permitiendo que los sustratos se conviertan en los productos que necesita la célula.
Como todo catalizador, los enzimas no se consumen en las reacciones que catalizan, pero a
diferencia de otros catalizadores de naturaleza inorgánica, las reacciones que catalizan son muy
específicas: sólo interaccionan con determinados sustratos, y sólo facilitan el curso de
determinada s reacciones.

Un enzima que podemos encontrar en todos los seres vivos es la catalasa, necesaria para
descomponer el peróxido de hidrógeno, un compuesto tóxico, que se produce durante el
metabolismo celular.

Objetivos:

● Familiarizarse con las propiedades de los enzimas y observar la actividad de

la catalasa
● Entender por qué se utiliza el peróxido de hidrógeno como desinfectante y el
uso de la catalasa en alimentos como antioxidante.

Material y recursos necesarios:

●Vasos de precipitados
●Tubos de ensayo
●Embudos de vidrio
●Agua oxigenada
●Agua destilada
●Fuente de catalasa: papa
●Cronómetro (puede utilizarse el del teléfono móvil)
Procedimiento:

1. Cortar la papa en cinco trozos de igual tamaño (1g aproximadamente).

2. Rotular cinco vasos de precipitados con los números 1,2,3,4 y 5
3. Realizar cinco disoluciones de agua oxigenada (0, 25, 50, 75 y 100 %)
4. Introducir un trozo de patata en cada vaso, a continuación, la disolución de agua
oxigenada correspondiente y cubriendo la patata colocar el embudo en posición invertida.
El extremo del embudo debe quedar por debajo de la superficie de la disolución. Comprobar
que el agua entra con facilidad dentro del embudo, en caso contrario colocar debajo del
embudo algo que lo levante unos milímetros.
5. Llenar los tubos de ensayo con la disolución correspondiente y con mucho
cuidado para que no entre aire introducirlos por la parte estrecha del embudo.

6. Cuando transcurran 20 minutos marcar con un rotulador la cantidad de oxígeno

acumulado en el extremo de cada tubo.

7. A continuación, medir el volumen de oxígeno, llenando el tubo de ensayo con

agua hasta la marca realizada, con ayuda de una pipeta de 10 ml.