Práctica 12: “Extracción de ADN a partir de un pez”

Asignatura: Procesos Metabólicos

Licenciatura QFBT
Fecha de entrega: 1 de junio de 2020

RESUMEN
Se realizó una práctica para extraer ADN a partir de un pez. Para esta práctica
se utilizó un pez tigre, al que se le realizó un corte en su aleta. Lo primero fue
añadir el buffer de lisis a la aleta en un tubo eppendorf y se le dieron choques
térmicos ya que se quiere eliminar el RNA en la muestra. Se centrifugó y se
extrajo el sobrenadante al que se le añadió una mezcla de Fenol: Clofroformo:
Alcohol Isomaílico. Se centrifuga otra vez y se observan dos fases, una acuosa
y otra inferior. Se recupera la fase acuosa y se le añade un agente de Cloroformo:
Alcohol Isoamílico. Se centrifuga y de nuevo se observan dos fases. Se recupera
el sobrenadante, se le añade acetato de sodio y etanol al 100%. Después de
esto, se logra observar el ADN como si fuera un hilo mezclado.
Se incuba temperatura bajo cero, se centrifuga nuevamente y observamos un
pellet que sería nuestro ADN acumulado. Ahora nos deshacemos del
sobrenadante. Se centrifuga por última vez y se quita el sobrenadante. Se pone
el tubo de cabeza sobre papel y se deja evaporar el etanol. Finalmente, se incuba
en baño María.

Palabras clave: Extracción, ADN, pez tigre, aleta, buffer, tubo eppendorf,
agente, centrifugar, pellet, sobrenadante, fases, etanol, cloroformo, fenol, alcohol
isomaílico, incubación, baño María.

INTRODUCCIÓN

El ADN forma genes, el material el ADN se encuentra principalmente

hereditario de las células, y contiene en el núcleo, pero también en las
instrucciones para la producción de mitocondrias y en los cloroplastos. El
todas las proteínas que el organismo ADN contiene las bases púricas
necesita. En las células eucariotas, Adenina (A) y Guanina (G) y las

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bases pirimidícas. Citosina (C) y una o varias proteínas utilizando
Timina (T), junto con el azúcar diversos ARNs como intermediarios
desoxirribosa y el fosfato. Una de las como los ARN de transferencia
características del ADN son (ARNt) y ARN ribosomales (ARNr).
complementariedad de las bases La extracción y purificación de
nitrogenadas, antiparalelismo de las ácidos nucleicos constituye la
dos hebras, hebras diferentes, primera etapa de la mayoría de los
helicidad y carácter dextrógiro. Tiene estudios de biología molecular y de
diferente estructura; primaria, todas las técnicas de recombinación
secundaria y terciaria. La primaria es de ADN. En este caso, los métodos
la secuencia de nucleótidos de una de extracción permiten obtener
sola cadena y se pueden distinguir ácidos nucleicos purificados a partir
en ella un esqueleto de pentosas y de diversas fuentes para después
fosfatos y una secuencia de bases realizar análisis específicos de
nitrogenadas, el número de hebras modificaciones genéticas mediante
diferentes de ADN que se puede la reacción en cadena de la
formar combinando las cuatro bases polimerasa (PCR). La calidad y la
nitrogenadas es muy elevado. La pureza de los ácidos nucleicos son
estructura secundaria del ADN es la dos de los elementos más
disposición espacial en doble hélice importantes en ese tipo de análisis.
de dos cadenas de polinucleótidos, Si se desea obtener ácidos nucleicos
con las bases nitrogenadas muy purificados, que no contengan
enfrentadas y unidas mediante contaminantes inhibidores, es
puentes de hidrógeno y finalmente la preciso aplicar métodos de
terciaria se refiere a como se extracción adecuados. El método de
almacena el ADN en un volumen extracción de ADN con solventes
reducido, esto varía según se trate orgánicos, es uno de los muchos
de organismos procariontes o métodos que existen, este método
eucariontes. El ordenamiento y consiste en la purificación de ADN
secuencia de los nucleótidos forma mediante la adición de fenol y
un polímero de ADN de doble cloroformo lo que da lugar a la
cadena, el cual se traduce en un aparición de 2 fases: una fase
ARN mensajero (ARNm), este ARN acuosa superior que contiene los
contiene la información para generar ácidos nucleicos y una fase orgánica

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que contiene las proteínas disueltas  Puntas de micropipeta y
en el fenol y los lípidos disueltos en pipeta.

el cloroformo. Para la purificación de  Baño de agua.

ADN el fenol debe tener un pH≈7-8.  Papel de filtro / papel

secante.
Posteriormente se precipita el ADN
de la fase acuosa con isopropanol o Sustancias

etanol absoluto y se lava con etanol  Extracción Buffer 200ML

al 70% para eliminar sales y  TE Buffer
pequeñas moléculas orgánicas que  Fenol: cloroformo: alcohol
podrían aún estar presentes en la isoamílico (50 ml)

muestra. Por último, el ADN se  Cloroformo: alcohol

isoamílico (50 ml)
resuspende en un tampón
apropiado. Aunque en realidad se  70%, 100% de etanol
(helado).
nota la presencia de tres fases la
 Acetato de sodio 3M.
fase acuosa, proteínas y fase
fenólica.
MÉTODO
1. Extraer 20-100 mg de aleta de
OBJETIVOS
pescado con un bisturí estéril
 Aislar el ADN de las aletas de y unas pinzas.
pescado. 2. Homogeneizar las aletas en
 Obtener la forma purificada de 600 μl de tampón de
extracción con mortero y
ADN que se puede utilizar para el
mortero estériles.
análisis molecular.
3. Recoja la pasta en un tubo de
 Comprender el principio y el microcentrífuga de 1,5 ml
proceso de extracción de ADN. (MCT).
4. Incubar a 37 ° C durante 1
MATERIALES hora en un baño de agua.

 Aletas de pescado 5. Vuelva a incubar a 55 ° C

durante 1 hora en el baño de
 Bisturí. agua.
 Pinzas. 6. Centrifugar a 5000 rpm
 Mortero y mortero. durante 10 minutos.

 Centrífugo. 7. Retire el sobrenadante,

colóquelo en un nuevo MCT y
 Viales agregue el mismo volumen de

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 fenol cloroformo: alcohol 16. Resuspender el sedimento en
isoamílico. Mezcle lenta y 50-100 μl de tampón TE o
completamente por inversión agua destilada triple estéril.
repetida del MCT.
17. Agregue 2.0μl de RNAse a
8. Centrifugar a 12000 rpm 100μl de solución de ADN y
durante 10 minutos y recoger luego mantenga la muestra a
la capa acuosa superior en un 37 ° C durante 2 horas.
MCT nuevo. No molestar a la
18. Electroforesis de la muestra
capa intermedia.
en un 0,7% de gel de agarosa.
9. Añadir cloroformo: alcohol
19. Estime la concentración de
isoamílico en la
ADN a 260 nm.
proporción. Mezcle lenta y
Concentración de la muestra
completamente por inversión
= Factor de dilución X
del tubo.
Absorbancia.
10. Centrifugue el tubo a 12000
20. Diluir el ADN para hacer la
rpm durante 10 minutos.
concentración entre 10-100μ
11. Recoja la capa acuosa en un g / ml.
MCT nuevo y agregue 0,1
21. Use 1 μl de muestra de ADN
volúmenes de acetato de
para PCR (reacción en
sodio 3 M y un volumen igual
cadena de la polimerasa).
de etanol helado
(100%). Mezcle bien la 22. Mantenga la muestra a -20 °
solución hasta obtener el C o liofilice la muestra con
sedimento de ADN. nitrógeno líquido.
12. Incubar el MCT a -20 ° C
durante 1 hora.
13. Saque el tubo y centrifugue a RESULTADOS
1000 rpm durante 10 minutos
y decante el sobrenadante.
14. Lave el tubo con etanol al
70%, centrifugando a 1000
rpm durante 10 minutos y
decante el etanol
cuidadosamente sin perder el
sedimento. Figura 1. Pez tigre
15. Seque al aire los gránulos de
ADN a temperatura ambiente
manteniendo el tubo abierto y
luego seque con papel de
filtro / papel secante.

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Figura 2. Corte en la aleta Figura 8. Mezcla de sobrenadante
con 300 μl de agente Fenol:
Cloroformo: Alcohol isoamílico

Figura 3. Muestra en choque térmico

Figura 9. Formación de dos fases

Figura 4. Centrifugación

Figura 10. Observación del ADN

Figura 6. Formación del pellet

Figura 11. Incubación a -20°C del

ADN

Figura 7. Transferencia del

sobrenadante

Figura 12. Resuspensión

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 proteínas y lípidos, 3. Precipitación
del ADN 4. Remoción del RNA

En este estudio, la aleta de pez

Figura 13. Evaporación del etanol a
representó una fuente de ADN tan
temperatura ambiente.
conveniente como la de otros tipos
de tejidos (músculo, hígado, sangre)
DISCUSIÓN
presentando alta cantidad y calidad
Es importante saber cuáles con los
total de ADN aislado. Estos
pasos y reactivos que se utilizan
resultados coincidieron con Wasko
para extraer el ADN de células
et al, (2003) y Nam et al. (2003),
animales y vegetales para ver si el
quienes obtuvieron una buena
ADN esta mutado o si tiene
extracción de ADN de aletas.
problemas como por ejemplo el
Además, es destacable su facilidad
cáncer y otras enfermedades que
de colecta y confiabilidad, en
puedan afectar el ADN. En el
comparación con muestras de
laboratorio virtual observamos los
músculo o sangre. La aleta del pez
pasos que se deben hacer para la
es fuente confiable de ADN y han
extracción de ADN por medio de una
sido usadas exitosamente en varios
muestra de pez para sacar copias de
estudios poblacionales y
ADN por medio de 2 métodos
taxonómicos
llamado PCR y electroforesis.

CONCLUSIÓN
Esta prueba es un método simple,
La extracción de ADN de la aleta del
reproducible, económico y no
pescado nos proporciona un tejido
contaminante, posible de utilizar
óptimo que no daña al pez y nos
para la obtención de ADN a partir de
permitió la liberación de ácidos
muestras de aleta.
nucleicos. Actualmente se han
Mediante asta practica de extracción
encontrado muchas formas de aislar
de ADN Cinco pasos fueron
ADN y perfeccionar técnicas que nos
esenciales en el proceso de
han ayudado a estudiar las causas
extracción con sal común: 1.
genéticas de las enfermedades, para
Liberación de componentes
obtención de diagnósticos, como
celulares, 2. Eliminación de
prueba de paternidad, para la

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medicina forense y para detectar 4. Las herramientas moleculares,
bacterias o virus en el medio Extracción de ácidos nucleicos
Luisa I. Falcón y Aldo Valera
ambiente. URL:
El ADN aislado tiene un impacto http://www2.inecc.gob.mx/public
aciones2/libros/530/cap16.pdf
cada vez mayor en nuestra
sociedad, ya que sus usos van 5. Comparación entre 5 métodos
desde pruebas de paternidad hasta para la extracción de ADN de
comprobar un crimen cometido por Triatomíneos: su utilización en la
parte de un sospechoso; también técnica de ADN polimórfico
puede indicar a qué enfermedades amplificado al azar (RAPD), Lic.
es propensa una persona por su Jorge Fraga Nodarse, Instituto de
genética, para tomar medidas Medicina Tropical ¨Pedro Kourí¨,
preventivas y evitar desarrollarla. Rev Cubana Med Trop v.56 n.3
Ciudad de la Habana sep.-dic.
REFERENCIAS 200
1. Alberto Checa Rojas. (2017).
ADN: Conceptos básicos y
aplicaciones. 2020, mayo 31,
Conogasi.org Sitio web:
http://conogasi.org/articulos/adn-
conceptos-basicos-y-
aplicaciones/

2. Orfao, A., Morent, M. (2011). PNT

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS. Madrid 2011, de
Red Biobancos Instituto de salud
Carlos III Sitio web:
https://redbiobancos.es/wp-
content/uploads/pnt-extraccion-
acidos-nucleicos.pdf

3. Somma M. Extracción y
Purificación de ADN., de JRC
European Commission Sitio web:
https://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuild
ing/manuals/Manual%20ES/Sesi
on4.pdf