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Prctica 2: Estudio microscpico de los microorganismos.

Tincin simple, tinciones diferenciales y selectivas.

Debido a que la mayora de los microrganismos son translucidos, en esta prctica se nos
proporcionaron diversos microrganismos para aprender a realizar adecuadamente las
preparaciones y tinciones ms utilizadas que existen; tincin simple, tinciones
diferenciales (de Gram y BAAR) y selectivas (de capsula y endospora). Todo esto se hizo
con el fin de poder identificar y describir correctamente algunas caractersticas
microscpicas de las bacterias, tales como forma, agrupacin, si son BAAR positivas, la
presencia de cpsula o endosporas y clasificarlas como Gram positivas o Gram negativas.
Anlisis de resultados

Resultados
Tincin simple
organismo

Forma

Color

Saccharomyces
cerevisiae

Ovalada

morado

Tincin de Gram
organismo

Forma

Agrupac.

Color

Gram

S. oralis

Cocos

azul

Proteus sp

Bacilo
corto

Estreptoco
cos
________

rosa

Tincin BAAR
organismo

Forma

Color

Mycobacterium

Bacilo

rosa

BAAR
+

Tincin negativa de capsula


organismo

Forma y color

L. mesenteroides

No se pudo observar

Pulque

Diplococos rosas

Tincin selectiva de endospora


organismo
Forma
Color
B. cereus
bacilo
Rosa y verde
la capsula
Una vez seco el frotis, este se fija
pasndolo por el fuego del mechero por

Para todas las tinciones se establece una


zona asptica limpiando el rea de
trabajo y prendiendo el mechero, se
trabaja a un radio de 12 cm de ella, con
un asa bacteriolgica esterilizada se
procede a tomar la muestra, si se trata
de un cultivo slido, se coloca una
pequea gota sobre el cubreobjetos
antes de colocar la muestra.
Para preparar el frotis de las muestras,
primero se quit la torunda del tubo,
luego se flamea la boca del tubo y se
enfra el asa dentro del el mismo, se
toma la muestra, si sta es lquida se
cuida de que se forme una pelcula en el
asa, se coloca sobre el portaobjetos y se
hacen crculos concntricos en el
portaobjetos hasta que la muestra quede
bien extendida, esta no debe ser ni muy
delgada
ni
muy
gruesa
para
garantizarnos que tenemos una buena
cantidad de microorganismos para teir,
despus se deja secar al aire libre.
En el caso de la tincin de capsula, en
vez de colocar una gota de agua, se usa
una gota de tinta que no tenga afinidad
por alguno de los constituyentes de la
capsula, para poder crear un contraste
con el medio y as poder ver la capsula
de los microorganismos ya que esta se
ver translucida.
intervalos de 2 segundos, tres veces.
Esto se hace para todas las muestras

excepto las de tincin de capsula, ya que


esta capsula que est constituida de
polisacridos desaparecera al pasarla
por la flama.
En la tincin simple se usa un solo
colorante, que es de tipo bsico como
safranina, azul de metileno o cristal
violeta, el cual se deja actuar por un
minuto.
Se utilizan solamente para incrementar el
contraste, todas las clulas absorbern el
colorante y quedan teidas del mismo
color. En nuestro caso usamos cristal
violeta para teir una muestra de
Saccharomyces cerevisiae, con esta
tincin conseguimos observar la forma
de la levadura, la cual era ovalada y en
efecto se tio de color morado al ser
absorbido y adherido el colorante debido
a la reaccin que se lleva a cabo entre el
colorante y los componentes de la pared
de estas levaduras.
Las tinciones diferenciales se usan para
distinguir entre distintos tipos de
microorganismos.
La tcnica de tincin diferencial consta
de una tincin primaria, decoloracin y
tincin de contraste. Ejemplo de estas
son la tincin de Gram y la tincin de
cido-alcohol
resistencia,
ambas
aplicadas a bacterias.
Para la tincin de Gram utilizamos dos
microorganismos
distintos
para
clasificarlos como Gram (+) o Gram (-).
Esta diferencia se consigue por las
diferencias que hay en la composicin de
las paredes celulares de estos dos tipos
de bacterias, ya que esto las har teirse
de morado o rosa segn sea el caso.
S. oralis y Proteus sp fueron nuestras
muestras para realizarles esta tincin. A
ambas les adicionamos cristal violeta
como colorante primario por 1 minuto,
este hizo que todas las clulas se tieran
de color morado, para afianzar el
colorante se utiliz Lugol como
mordente. Despus se procedi a lavar

las muestras con alcohol-cetona, la


pared de peptidoglicano de una Gram (+)
contiene acidos teicoicos y lipoteicoicos y
es gruesa, esta solo se deshidrata y
adelgaza con este lavado, pero retiene el
primer colorante, en cambio la pared de
una Gram (-) al ser ms delgada y
poseer una membrana externa de
lipopolisacaridos, ambas desaparecern
con el lavado y dejaran salir el colorante
que estaba en el citoplasma de la clula
bacteriana dejndola incolora. Como
colorante de contraste se us safranina,
la cual tie de rosa a las bacterias que no
retuvieron el cristal violeta debido a que
su pared desapareci por el lavado con
alcohol acetona.
Se denomina Gram (+) a las clulas
teidas de morado y como Gram (-) a las
que se tieron de rosa.
A S. oralis la clasificamos como una
Gram (+) ya que se tio de color moradoazul, a parte este tipo de tincin nos
proporcion informacin sobre su
morfologa y agrupacin, la cul era en
forma de coco formando cadenas
(estreptococos).
Proteus sp se tio de color rosa, lo que
indica que es una Gram (-), no hubo una
agrupacin en especfica para esta
bacteria con forma de bacilo corto.
La otra tincin diferencial que se uso fue
la de BAAR o de Ziehl-Neelsen, este tipo
de tincin tambin se basa en la
composicin de la pared celular
caracterstica de algunas bacterias.
Mycobacterium fue el microorganismo al
que le aplicamos esta tincin.
Ya que estas bacterias poseen una pared
celular de peptidoglicano delgada, pero
sobre ella tienen una capa gruesa de
cidos micolicos y ceras constituida de
arabinogalactanos, es necesario aplicar
calor por un lapso de 10 minutos para
ablandar estas ceras y permitir el paso
del primer colorante que para este caso
fue fuccina fenicada. A diferencia de la

tincin de Gram donde se utilizaba Lugo


como mordente, en esta tincin se usa
vapor de agua para facilitar la
penetracin del primer colorante.
Otra caracterstica distinta entre estas
dos tinciones, es que en la BAAR se
lava a la muestra con cido clorhdrico
disuelto en etanol y posteriormente se
usa un colorante especial, que no es
bsico como en la de Gram, sino que es
de carcter acido, nuestro colorante de
contraste fue el azul de metileno de
Loeffer, este segundo colorante tie de
azul a todas la clulas que son BAAR (-),
mientras que las BAAR (+) permanecen
color rosa ya que retuvieron al primer
colorante debido a que aunque hayan
perdido su delgada pared en el lavado,
su capa de cidos micolicos y ceras lo
retuvieron dentro de la celula.
En ambas tinciones diferenciales, el
punto crtico es el lavado para decolorar.
Mycobacterium se tio de color rosa y es
considerada una BAAR (+) y esta tincin
nos permiti ver que su forma era bacilar.
Mientras que las tinciones diferenciales
nos permiten distinguir entre distintos
tipos de microorganismos, las tinciones
selectivas nos permiten observar una
estructura u organelo en especfico, los
ms comunes son las endosporas, los
flagelos y las cpsulas.
Las bacterias del genero Bacillus y
Clostridium se caracterizan por generan
estructuras de resistencia denominadas
esporas, estos organelos presentan
numerosas capas que se denominan
exosporio, cubierta de la espora y cortex.
Para identificar si un microorganismo es
esporulado se realiza una tincin
selectiva de endospora.
Como en las tinciones diferenciales, en
esta tambin se utiliza un colorante
primario; el verde de malaquita que en
efecto tio las esporas de nuestra
muestra de B. cereus. Al igual que en la
tincin de BAAR, en esta tincin se utiliza

como mordente al calor generado por el


vapor de agua durante 10 minutos para
ablandar las capas de la espora mientras
se agrega colorante evitando que este se
seque. Este colorante tie de verde las
esporas y como colorante de contraste
se us safranina al 0.5% para teir a las
clulas vegetativas.
La ultima tcnica que se uso fue la
tincin negativa de capsula, donde se
lograron observar las cpsulas de la
bacteria del pulque al crear un contraste
con el medio, estas estaban rodeadas de
negro y eran translucidas, pero no
se tieron debido a que las partculas de
colorante no penetran la cpsula y no
reaccionan con lo polisacridos de la
misma.
L. mesenteroides fue la otra muestra con
la que trabajaos, pero debido a una mala
preparacin y extendido de la muestra,
no se consigui observar su capsula. Lo
mismo hubiera pasado si fijramos la
muestra con calor.

Conclusin:
Mediante la realizacin de estas
tinciones y la preparacin de un correcto
frotis, se logr hacer una clasificacin,
observar la forma, agrupacin y algunas
estructuras de varios microorganismos.
As mismo, las diferentes tcnicas de
tincin que existen son de gran utilidad
en la microscopia de campo claro ya que
nos permiten teir las clulas y aumentar
as su contraste facilitndonos su
observacin y estudio.

Bibliografa
Manual de prcticas de microbiologa
experimental (1515), FQ, UNAM
M. T. Madigan, J. M. Martinko, J. Parker.
Brock Biologa de los Microorganismos,
10 edicin, Pearson Prentice Hall,
Madrid, 2004, pag: 57-59, 91-92, 96.