EVALUACION DE LA CANTIDAD

Y CALIDAD DEL ADN

DAHYANA BOLAÑOS BURBANO

AUTORES
Alerson Guaza Cotes -Magali Andrea Gutiérrez Fernández – Ana Lucia Sarmiento Bejarano

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

4/10/2021
LABORATORIO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

RESUMEN

En la práctica de laboratorio se cuantifica y determina la pureza del ADN extraído S. cerevisiae

mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel de
agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas
procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN de diferente tamaño van a
emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Para realizar este laboratorio se
utilizaron los siguientes reactivos TBE 1X, Agarosa en polvo, Buffer de carga, Sybr Green, Marcador
de peso molecular, Muestra de ADN, Agua MiliQ. Donde se evidencio que la electroforesis y
espectrofotometría dieron resultados positivos que nos ayudó a determinar la pureza del ADN
extraído y determinar la cantidad encontrada.

Palabras clave: espectrofotometría, electroforesis, gel de agarosa, ADN, S.cervisiae

In laboratory practice, the purity of the extracted S. cerevisiae DNA is quantified and determined
by spectrophotometry and agarose gel electrophoresis. Agarose gel electrophoresis is one of the
most used to analyze and characterize nucleic acids from different sources. Gels behave like a
molecular sieve and allow charged molecules to be separated based on their size and shape. Thus,
DNA molecules of different sizes will migrate differently in agarose gel electrophoresis. To carry
out this laboratory, the following reagents TBE 1X, Agarose powder, loading buffer, Sybr Green,
Molecular weight marker, DNA sample, MiliQ water were used. Where it was evidenced that
electrophoresis and spectrophotometry gave positive results that helped us determine the purity
of the extracted DNA and determine the amount found.

Keywords: spectrophotometry, electrophoresis, agarose gel, DNA, S.cervisiae

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INTRODUCCION

El ADN, científicamente conocido como ácido desoxirribonucleico, es la molécula que contiene la

información genética en todos los seres vivos. Consiste en dos cadenas que se enrollan entre ellas
para formar una estructura de doble hélice. Cada cadena tiene una parte central formada por
azúcares (desoxirribosa) y grupos fosfato. Enganchado a cada azúcar hay una de las siguientes 4
bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G), y timina (T). Las dos cadenas se mantienen unidas por
enlaces entre las bases; la adenina se enlaza con la timina, y la citosina con la guanina. La
secuencia de estas bases a lo largo de la cadena es lo que codifica las instrucciones para formar
proteínas y moléculas de ARN. Para poder observar esta molécula se requieren de varios procesos
y se pueden utilizar diferentes metodologías. Una de las metodologías es por medio de la
centrifugación, con este método se agregan ciertos reactivos para condensar, separa, cuidar y
mantener el ADN hasta su observación. A su vez se utiliza el proceso de espectrofotometría y
electroforesis en gel de agarosa para obtener una observación más detallada. Con estos métodos
se puede saber si la muestra de ADN está contaminada, determinar la pureza del mismo,
determinar la calidad y la cantidad.
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METODOS Y MATERIALES

MATERIALES REACTIVOS
1.Balanza TBE 1X
1 Beaker 250 mL Agarosa en polvo
1 Vidrio reloj Buffer de carga
1 Microespátula Sybr Green
1 Probeta de 50 mL Marcador de peso molecular
Microondas Muestra de ADN
Cámara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Cinta de enmascarar
1 Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas
Trans iluminador UV

Para determinar si las muestras tomadas

tuvieron una buena calidad se tendrá en
cuenta la siguiente tabla donde 3 es la mejor
calificación y 0 la peor.

Técnicas de análisis Parámetros Criterios validez puntuación

ELECTROFORESIS INTEGRIDAD Banda definida en la parte superior del gel. 3
GEL AGAROSA DEL ADN Integridad alta
Presencia simultánea dela banda en la parte 2
superior del gel y un ligero smear.
Integridad adecuada
Ausencia de banda definida y presencia de 1
smear concentrado en la parte superior del
gel. Parcialmente degradado
Smear concentrado en la parte inferior del 0
gel. Totalmente degradado
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Tabla 1. Criterios de validez y puntuación asignada según la integridad asignada en el gel

agarosa.
RESULTADOS Y DISCUCIONES

A B C D E

F G H

Imagen 1: muestras del ADN por electroforesis

De acuerdo a la tabla 1 y la imagen 1 se observaron los siguientes resultados.

Muestras de ADN Puntuación Observaciones

A 0
B 2
C 2
D 2
E 1
F 1
G 3
H 3
Smear concentrado en la parte inferior del gel. Totalmente
degradado
Presencia simultánea dela banda en la parte superior del gel y
un ligero smear. Integridad adecuada
Presencia simultánea dela banda en la parte superior del gel y
un ligero smear. Integridad adecuada
Presencia simultánea dela banda en la parte superior del gel y
un ligero smear. Integridad adecuada
Ausencia de banda definida y presencia de smear concentrado
en la parte superior del gel. Parcialmente degradado
Ausencia de banda definida y presencia de smear concentrado
en la parte superior del gel. Parcialmente degradado
Banda definida en la parte superior del gel. Integridad alta
Banda definida en la parte superior del gel. Integridad alta

CONTAMINACION DEL ADN

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De acuerdo a la imagen 1 se observa cual es la calidad de las muestras y que tipo de

contaminación tiene.

Muestras de ADN ¿Presenta contaminación?

A SI
B POCA
C POCA
D POCA
E SI
F SI
G NO
H NO
TABLA 2. Contaminación del ADN

De acuerdo a la tabla 2 se observaron los siguientes resultados:

 Las muestras de ADN A, E y F se mostraron bastantes contaminadas ya que la longitud de

la banda no se muestra muy definida lo que significa que está contaminada con posibles
proteínas, fenoles y otras sustancias o un mal manejo de la muestra.

 Las muestras de ADN B, C Y D se mostraron con poca contaminación ya que la longitud de

la onda se muestra definida pero se ve contaminación.

 Las muestras G y H no se mostraron contaminadas ya que la longitud de la banda se

muestra bien definida y sin ningún tipo de contaminación.

¿CÓMO DISMINUIR LA CONTAMINACIÓN DEL ADN?

La mayoría de muestras siempre están expuestas a sufrir contaminación debido a la exposición

que tienen, el mal manejo también es un factor que ayuda a que las muestras a contaminarse,
para evitar la contaminación del ADN por proteínas y carbohidratos siempre es primordial el buen
manejo, la buena asepsia y evitar la exposición en los medios

METODOS DE CUANTIFICACION DE ADN

Existen varios métodos, algunos son:

 La cuantificación por Real Time PCR permite monitorizar la reacción de PCR al mismo
tiempo que éste tiene lugar. Otros métodos de cuantificación basados en la PCR miden la
cantidad de producto generado al final de la reacción de amplificación y luego estiman la
concentración de DNA de los extractos. Sin embargo, en la cuantificación por Real Time
PCR la detección comienza durante los primeros ciclos de amplificación, cuando la
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cantidad de producto amplificado sobrepasa un determinado umbral. Cuanto mayor es el

número de copias presentes en el extracto de DNA, antes se sobrepasa este umbral y se
inicia la detección.
 El método indirecto más recomendable para la determinación de la concentración de ADN
en una muestra es mediante la visualización de un gel de electroforesis en el cual se
colocan muestras con concentraciones conocidas.
 En este método se utiliza un espectrofotómetro que mida la absorbancia a 260nm y
280nm.

EL NANODROP Y EN SU CONSISTENCIA

El NanoDrop es un espectrofotómetro UV-VIS de barrido espectral que mida la variación de la

absorbancia con la longitud de onda empleando solo una micro-gota y opcionalmente en cubeta.
Permite la medición rápida, fiable y reproducible de pureza de DNA, RNA y proteínas en
volúmenes de microlitro, mostrando todo el espectro para detectar impurezas.

Tan sólo requiere un volumen de muestra de 1-2 μl y gracias a su pequeño tamaño y fácil manejo
permite medir un gran número de muestras en poco tiempo.

Su funcionamiento se basa en el empleo de un sistema de retención de muestra que aprovecha la

tensión superficial para formar un puente de líquido entre el pedestal inferior y un pedestal
superior. En los espectrofotómetros NanoDrop el pedestal superior es el extremo de una fibra
óptica conectada a una fuente de emisión de Xenon. Ambos pedestales definen un preciso y
estrecho paso óptico cuya longitud varía automáticamente con la concentración de la muestra,
permitiendo hacer mediciones en un rango muy amplio de concentraciones sin hacer diluciones.
Esta característica lo hace idóneo para determinar la concentración y pureza de los ácidos
nucleicos.

CONCLUCIONES

La electroforesis Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un

campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN,
tienen por naturaleza carga negativa. En conclusión, y teniendo en cuenta la exigencia que algunas
técnicas imponen en la calidad del ADN, como las tecnologías de alto rendimiento, este sistema
propuesto clasifica con detalle el ADN y ayuda a conocer de antemano qué tipo de aplicaciones
podrían realizarse con posterioridad facilitando la tarea del investigador. das de diferentes
muestras biológicas.

REFERENCIAS

 https://www.lrdiagnostico.com/nanodrop-one-espectrofotometro-de-microgota-con-
pedestal-yo-cubeta/
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 https://www.idipaz.es/ficheros/files/Que%20es/2015/NANODROP(2).pdf
 https://www.redalyc.org/pdf/693/69325096011.pdf
 https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/ADN-acido-Desoxirribonucleico
 https://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf
 https://www.tesisenred.net/bitstream/handle/10803/795/04.TESIS_EFD_METODOS.pdf?
sequence=5&isAllowed=y
