SEPARACIÓN DE ADN POR ELECTROFORESIS HORIZONTAL

EN GEL DE AGAROSA

SEPARATION OF DNA BY HORIZONTAL ELECTROPHORESIS

IN GEL DE AGAROSA
1
Cely García María Camila-1611302; 2Mejia Morales Angelica Dayana-1611314; 3Gutierrez
Flores Arley Andres-1611298; 4Moreno Pérez José Neftali-1611349.
1
Mariacamilacg@ufps.edu.co; 2Angelicadayanamm@ufps.edu.co; 3Arleyandresgf@ufps.edu.co;
4
joseneftalimp@ufps.edu.co

Universidad francisco de paula Santander, facultad de ciencias agrarias y del ambiente,

ingeniería biotecnológica- biología molecular, grupo A; 10 de abril del 2019.

INTRODUCCION

Una vez extraído el ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto, es mediante
la cuantificación. Según el método que se utilice, se puede apreciar la cantidad de ácidos
nucleicos totales, proteínas presentes, pureza del extracto, ADN humano solamente, etc.

El determinar cuánto ADN hay y su pureza en un extracto, es muy importante en muchos de los
ensayos basados en PCR. Por ejemplo, existen ensayos que resultan mejor si la concentración de
ADN es baja. En casos donde hay mucho ADN, podría inhibirse la PCR o los resultados podrían
presentar picos que se salen de la escala los cuales imposibilitan el análisis. Este tipo de
contratiempos se pueden evitar al hacer diluciones de extracto luego de la cuantificación. Por el
contrario, donde hay muy poco ADN se pueden presentar falsos negativos por una falla en la
amplificación (Butler, 2001); se puede tratar de corregir si se sabe que hay poco ADN al agregar
mayor cantidad de muestra a la reacción de PCR.

Cuantificación Espectrofotométrica
Una característica del ADN es la de presentar un pico de absorción en presencia de radiación a
260nm. Este pico de absorción se debe la presencia de las bases púricas y pirimídicas. El ADN
bicatenario presenta una absorción menor que el monocatenario, debido a que el emparejamiento
de las bases (por enlaces de puentes de hidrógeno) reduce la absorción de la luz ultravioleta
(figura 1) (Madigan et al 1998). Esta particularidad es aprovechable en la cuantificación de
ADN; sin embargo, así como encontramos ADN en la muestra, también se encuentran
contaminantes tales como proteínas o fenol residual que pueden incurrir en un falso positivo. Es
decir, la absorbancia a 260nm no es específica para ADN.

La cuantificación espectrofotométrica también permite estimar la cantidad de ARN presente en

un extracto. La absorbancia del ARN se puede analizar en términos de proporciones, lo que
genera información útil de pureza. Por ejemplo, si la proporción entre la absorbancia de ARN a
260nm y 280nm es menor a 1.75, el extracto contiene contaminantes de tipo proteínico, y si la
proporción entre la absorbancia a 260nm y 230nm es menor a 2.0, existe contaminación por
carbohidratos en el extracto (Miesfeld, 1999).

Figura 1. absorbancia de DNA monocatenario y cadena de doble hélice

Electroforesis
La electroforesis de ácidos nucleicos consiste en la separación de moléculas que difieren en
longitud. Esta separación se logra al hacer migrar a los ácidos nucleicos, los cuales están
negativamente cargados, en un campo eléctrico uniformemente cargado a través de una matriz
sólida. La migración ocurre del cátodo al ánodo del sistema eléctrico en la cámara de
electroforesis. La electroforesis es el proceso utilizado para analizar los fragmentos amplificados
en PCR, también se puede analizar otros tipos de moléculas como por ejemplo, proteínas.
Cuando se trabaja con fragmentos menores a 500 nucleótidos de longitud, se utiliza una matriz
especialmente diseñada de poliacrilamida desnaturalizante, la cual permite separar las moléculas
de ácidos nucleicos que difieren hasta en un nucleótido (Alberts et al, 1994) lo que también
permite la secuenciación de los fragmentos. Existe otro tipo de electroforesis, la electroforesis
capilar, la cual es mucho más sensible y rápida. Esta permite no sólo la separación de las
moléculas, sino también la secuenciación de los segmentos amplificados de ADN, sin embargo,
es equipo muy costoso.

MATERIALES Y REACTIVOS

IMPLEMENTOS REACTIVOS EQUIPOS

Bata Buffer de carga Xilencianol + Cámara de electroforesis

azul de bromo fenol y
Orange.

Guantes Agarosa Fuente de poder

Tapabocas DNA extraído Transiluminador ( Chemidoc)

Gafas Buffer de corrida TBE 1X Micropipetas

Tips o puntas Intercalante Gel red

METODOLOGIA

1. Preparación del gel de agarosa al 0.7 %

Para la preparación del gel se procedió a medir un volumen de 50 mL de buffer de corrida (TBE)
y se adicionó 0.35 gramos de agarosa, se calentó el la plancha para homogenizar y posterior a
esto se esperó hasta que se redujera la temperatura a más o menos 40 °C para verterlo en el
molde, al tiempo se hizo el montaje de la cuna para el gel por lo que se debió nivelar con el ojo
de buey y se le incrustó la peinilla para permitir la formación de los pozos, se esperó 30 minutos
hasta que el gel se polimerizó y tomó un color blanco lechoso.

Figura 2. Preparación del gel de agarosa

Fig.3. Calibración de la cuna para el gel Fig. 4. Vertimiento del gel en el molde
2. Cuantificación de la muestra en el Nanodrop

Para este proceso se puso en funcionamiento el Nanodrop con el software, se procedió a

limpiarse con agua desionizada y calibrarse con TBE, posterior a ello se tomó 2 µL por aparte de
cada una de las muestras obtenidas en la práctica de extracción y purificación de DNA de hongos
(Trichoderma y M4H2) y se procedió a medir la cantidad de DNA presente en cada una de estas.

Fig. 5. Cuantificación de DNA en Nanodrop

3. Preparación de la muestra para el gel de agarosa al 0.7 %

Se tomó 10 µL de la muestra y se agregó 2µL del buffer de carga el cual fue Xilencianol + azul
de bromo fenol. Este paso se realizó con total cuidado agregando el buffer al fondo del
microtubo con el fin de que no se quedara adherido a las paredes del mismo.
 Muestra de
Muestra de
Trichoderma
M4H2

Fig. 6. Muestras para verter en el gel de agarosa

4. Cargue de muestra en los pozos y corrimiento del gel.

En este paso dos integrantes de cada grupo realizaron el descargue de 10 µL de la muestra en los
pozos asignados por la docente, se realizó con precaución de que la muestra efectivamente
cayera dentro del pozo, una vez realizado el cargue de los 8 pozos en total se procedió a dejar el
gel dentro de la cámara de electroforesis y se cubrió hasta su máximo con el buffer de corrida
(TBE) se cubrió la cámara posicionando el gel en dirección del polo negativo (Cátodo) al
positivo (ánodo)y de la misma forma conectando el negativo de la cámara con el negativo de la
fuente de poder y viceversa y se procedió a adicionar un voltaje de 110 V durante 1 minuto,
trascurrido este lapso de tiempo se redujo el voltaje a 100 V y se dejó correr el gel durante 40
minutos.

Fig. 7. Cámara de electroforesis Fig. 8. Corrida del gel

5. Visualización del gel en el Chemidoc.

Transcurrido el tiempo de corrido del gel se procedió a transportar el gel hasta el Chemidoc, se
ingresó la muestra con cuidado de no romperse y se puso en uso el software del equipo
especificando que era un gel de agarosa, el equipo visualizó el gel y tomó la respetiva fotografía
y luego se comparó los datos obtenidos en el Nanodrop y en el Chemidoc para su concordancia.

Fig. 9. Visualización del gel en el Chemidoc

ANALISIS DE RESULTADOS

FORMATO DE GUIA DE CONTROL DE ELECTROFORESIS

Electroforesis No. 1 Fecha: Abril 03 de 2019
% de agarosa: 0,7 Buffer de carga: Buffer de corrida: TBE Gel red
Xilencianol y azul de
bromofenol
Voltaje/corriente inicial: 110 Voltios Tiempo: 1 minuto
Voltaje/corriente final: 100 Voltios Tiempo de corrida: 40minutos
Carril Muestra Fotografía
1 A1Trichoderma
2 A1 M4H2
3 A2Trichoderma
4 A2M4H2
5 A3Trichoderma
6 A3M4H2
7 A4Trichoderma
8 A4 M4H2

Figura 10. Electroforesis de

Trichoderma sp y M4H2
Tabla 1. Resultados obtenidos en el gel de electroforesis.

Grafica 1. Relación 260/280-260/230 de la concentración del ADN

ANALISIS DE RESULTADOS

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los
ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y
estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al
final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las
moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de
un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular (Rocha, 2002).

Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de

fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la
visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente
analizadas e interpretadas. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados
requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de
acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan
tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal
generalmente se trabaja con ADN o ARN (Suarez, 2005).

La electroforesis en gel de agarosa es empleada para visualizar la integridad de ADN genómico y

para evaluar la presencia e integridad de las diferentes especies de ADN. Debido a que el gel de
agarosa no es desnaturalizante los fragmentos de menor tamaño se mueven con mayor facilidad a
través de los poros de la matriz de agarosa mientras que los fragmentos grandes se enfrentan a
mayor resistencia y por ende migran lentamente.

En este presente trabajo se realizó la extracción de ADN en hongo, utilizando como muestras
Trichoderma sp y M4H2 (muestra desconocida). Utilizando el polisacárido agarosa el cual es
soluble a temperaturas de 65°C. Este cuando se enfría forma un gel que las separa con respecto al
tamaño, peso y carga eléctrica. Se utilizó también buffer de corrida para la preparación del gel y
buffer de carga para mezclar el ADN.En la figura 8, se observa como las fuentes de migración
como el Xilencianol el cual se visualizade color azulal principio del gel contiene las partículas de
ADN más pesadas y grandes con +4000pb y el Azul de bromofenol observándose de color azul
en el gel, me indica que la cantidad de ADN del hongo extraído tiene un rango de +4000pb
(pares de bases) lo cual concuerda con la teoría ya que el ADN pesa de 8 a 10 kb (kilo bases)
esto me indica que el ADN entre más concentración tenga, va a ser más ajustado el paso por el
gel y va a llegar a un punto en donde no se va a mover y es por esto que se observan las bandas.

El equipo Chemidoc es un instrumento con todas las funciones para la captura y análisis de
imágenes de geles de proteínas, ADN y Western Blot. Su diseño está optimizado para la
detección de fluorescencia multiplex y la detección de quimioluminiscencia, así como otras
aplicaciones de documentación generales para geles de agarosa y poliacrilamida (Galénica
ciencia y tecnología, 2014).

En la figura 10, podemos visualizar la electroforesis capturada en el equipo Chemidoc, en donde

las muestras obtenidas por el grupo fueron las A1Trichoderma spy A1 M4H2 donde cabe destacar
que la muestra de Trichoderma sp no se logro visualizar de la manera correcta debido al mal
manejo realizado al momento de depositar el ADN en el pocito del gel haciendo que este no haya
sido cargado completamente y por lo tanto perdiéndose su visualización. En la muestra de M4H2
se observa de manera intensa y gruesa la banda esto es debido a la gran cantidad de
concentración que contiene lo cual concuerda con los resultados obtenidos en la cuantificación (a
mayor concentración mayor visualización del gel).

Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento mediante

espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de una molécula en
solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas. Una característica
del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentración
mediante espectrofotometría. Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el ADN, es de 1
cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO). En el caso de ADN genómico o de doble
cadena, una densidad óptica equivale a 50 ug/ml (Leninger 1975). Se debe considerar el factor de
dilución para obtener la concentración en nanogramos/microlitro (ng/ul).

En el caso de algunos equipos como el espectrofotómetro Nanodrop, no es necesario diluir la

muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentración en ng/ul. Para estimar la
pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Una
proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la
presencia de proteínas. Una segunda valoración de la pureza de ácidos nucleicos es la proporción
260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la relación es menor
indican la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol. (Lugert., et, al. 2006).

En nuestra práctica, se obtuvo una relación 260/280 de 2.15 para Trichoderma sp (grafica1), lo
cual nos indica contaminación por ARN, en M4H2 la relación 260/280 obtuvo un resultado de
2.27 (grafica 1), lo que también nos indica contaminación por ARN.

En la relación 260/230 para Trichoderma sp se obtuvo un resultado de 1.38 lo cual indica

contaminación por carbohidratos o fenoles, con una concentración de 3848.2 ng/µL y para
M4H2 dio un valor de -1.27, igualmente menor que 2, lo que indica contaminación por
carbohidratos o fenoles y para concentración se obtuvo un valor de 1056.4 ng/µL.

Los resultados de este estudio sugieren que la obtención de ADN genómico de Trichoderma y
M4H2 de buena calidad y pureza depende directamente del método de colecta, preservación de
la muestra, procedimiento exactos, lo que nos llevó a obtener resultados no viables de los que se
esperaban; por tanto, se puede concluir que el método o protocolo de extracción utilizado no
influyó en la calidad y pureza del ADN extraído.

CONCLUSIONES

 La cuantificación y la electroforesis nos permiten cerciorar la calidad y nivel de pureza

 Las relaciones de 260/280 presentan una pequeña contaminación por medio de la
cuantificación lo cual no se puede comprobar debido a que no se cargó la muestra debida
mente para la electroforesis.
 En la relación de 260/280 para M4H2 presenta una contaminación la cual se puede
comprobar con la electroforesis debido a que presenta un barrido, indicando contaminación
 Hay que tener en cuenta que al ahora de realizar la PCR estos contaminantes van a
interferir con al resultado.
CUESTIONARIO

A) ¿Qué función cumple el buffer de carga y qué otros colorantes se utilizan como buffers de
carga?

RTA/ Su función es facilitar la visualización y la precipitación de ácidos nucleicos o de

secuencias de genes producidos en PCR al tiempo que ayuda a conducir corriente para que se
haga efectiva la corrida de las moléculas en el gel y también ayuda a controlar el PH, Se pueden
emplear otros colorantes como buffer de carga los cuales pueden ser: Rojo cresol, Azul de
bromo fenol, azul de coomassie, naranja G, tartazina. (SOPs, 2008).

B) ¿Qué otras macromoléculas se pueden separar por electroforesis en gel? Y qué polímeros se
utilizan para cada uno.

RTA/ aparte del DNA también se puede separar RNA y proteínas paraestos se puede emplear
el gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). (García, H, 2001).

C) Consulte los tipos de electroforesis que existen y sus aplicaciones

RTA/ Electroforesis en papel para la separación de moléculas con bajo peso molecular como
los péptidos y los aminoácidos.Electroforesis en gel el cual se emplea en la separación de
macromoléculas como DNBA, RNA y proteínas.Electroforesis capilar para la separación de
pequeñas cantidades de moléculas como DNA RNA y proteínas, es empleada en técnicas
analíticas. Isoelectroenfoque empleado en la separación de proteínas. Ultracentrifugación para
el aislamiento de proteínas, ácidos nucleicos y partículas subcelulares (Voet & Voet, 2006).

D) ¿Qué tipo de marcadores moleculares existen y son de interés?

RTA/ Existen distintos tipos de marcadores moleculares como morfológicos, citogenéticas,

peptidicos, RFLPs(Restinction Fragment Lenght Polymorphisms) derivados de PCR y son
importantes porque se han empleado en procesos como la clonación, identificación y la selección
de genotipos, la variabilidad poblacional como ela estructura genética y las relaciones
filogenéticas en plantas, seguimiento a plantas y microorganismos modificados genéticamente
(Plaguiano, 2000).

E) El voltaje sugerido para la electroforesis en gel de agarosa es de 1 a 5 V / cm explique a qué

se refiere esta relación.

RTA/ Se hace esta relación con el fin de que todos los fragmentos de DNA en el gel de agarosa y
se puedan correr aquellos que tienen un tamaño igual o superior a 2 KB además la movilidad
electroforética del os fragmentos de DNA es inversamente proporcionales al logaritmo de su
tamaño expresado en pares de bases.

F) ¿Qué otros intercalantes se utilizan para reemplazar el bromuro de etidio y qué ventajas y
desventajas tiene?

El otro intercalante es el reactivo Gel Red para la visualización de ácidos nucleícos en

electroforesis en geles de agarosa, el cual de acuerdo a las pruebas realizadas en líneas celulares
por el fabricante no posee actividad mutagénica ni riesgo de contaminación ambiental, los
análisis de toxicidad y mutagénesis realizados en líneas celulares por el fabricante del reactivo
permitieron establecer que el Gel Red es incapaz de atravesar estructuras celulares. La tinción
con Gel Red es altamente efectiva y permite visualizar ADN total y diferentes fragmentos de
ADN previamente amplificado por PCR, razón por la cual se recomienda su uso para la
visualización de ácidos nucleicos(Uribe, 2013).
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