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DETERMINACIÓN DE PSEUDOMONA AERUGINOSA

ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR

Analista de Laboratorio Coordinador de Laboratorio Jefe de Laboratorio

Fecha Fecha Fecha
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TABLA DE CONTENIDO

1. OBJETIVO..........................................................................................................3
2. ALCANCE...........................................................................................................3
3. RESPONSABILIDAD..........................................................................................3
4. DEFINICIONES..................................................................................................3
5. RECURSOS.......................................................................................................3
6. PROCEDIMIENTO.............................................................................................4
6.1. GENERALIDADES:......................................................................................4
6.2. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.......................................4
6.3. INOCULACIÓN DE LAS PLACAS...............................................................5
6.4. INCUBACIÓN...............................................................................................6
6.5. INTERPRETACIÓN......................................................................................7
6.6. ANÁLISIS DE PRODUCTO TERMINADO...................................................7
6.7. REGISTRO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO..........................................8
7. OBSERVACIONES............................................................................................9
8. SEGURIDAD INDUSTRIAL................................................................................9
9. FORMATOS RELACIONADOS.........................................................................9
10. CONTROL DE CAMBIOS................................................................................9
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1. OBJETIVO

Establecer un procedimiento operativo estándar para la determinación

microbiológica de Pseudomona aeruginosa aplicado a aguas (potable, piscina,
purificada, destilada) y producto terminado por medio de la técnica filtración
por membrana.

2. ALCANCE

Este procedimiento aplica para aguas (potable, piscina, purificada, destilada) y

producto terminado.

3. RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del Analista capacitado, entrenado y autorizado por el

Gerente Técnico, Jefe de Laboratorio o quién designe, a través del formato
“Autorización del Personal del Laboratorio”, F-PT-001, versión vigente,
realizar la determinación microbiológica de Pseudomonas aeruginosa.

4. DEFINICIONES

 Medios de cultivo: conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de
los microorganismos.

 Colonia: Grupo o conjunto de microorganismos que se multiplican sobre

una superficie sólida como la de un medio de cultivo con agar; la colonia se
observa a menudo directamente, pero también puede verse con la ayuda
de un microscopio.

 Agar: agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.

 Inoculación: Introducción de una sustancia en un organismo.

 Autoclavado: este proceso se realiza en los autoclaves y el proceso

esterilizador se basa en la exposición del material a calor y presión

5. RECURSOS

 Cajas Petri
 Filtros de membrana estériles ≤ 0,45 µm
 Autoclave
 Asas de inoculación
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 Cabina de flujo laminar calificada.

 Incubadora calificada en 35°C ± 1,0°C y 41,5°C ± 0,5°C
 Ramba de filtración
 Bomba de vacío
 Matraz con salida lateral esmerilado
 Agar cetramida
 Agar M-PA
 Agar de leche
 Caldo digerido de caseína y soja

6. PROCEDIMIENTO

6.1. GENERALIDADES:

La técnica de filtración por membrana se basa en hacer pasar la muestra a través

de una membrana porosa delgada de no mayor a 0,45 µm, elaborada con plástico
de celulosa inerte, los poros son de tamaño uniforme lo suficientemente pequeños
para retener los microorganismos. Esta técnica involucra la filtración a través de
una membrana la cual se coloca en el equipo de filtración, donde los
microorganismos son atrapados en la superficie del filtro.

6.2. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

6.2.1. Agar M-PA modificado: este agar puede no estar disponible en forma
deshidratada y puede requerir preparación a partir de los ingredientes básicos, ver
tabla 1.
Tabla 1. Componentes del agar M-PA modificado

L-Lysine HCl 5,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g
Extracto de levadura 2,0 g
Xilosa 2,5 g
Sacarosa 1,25 g
Lactosa 1,25 g
Fenol rojo 0,08 g
Citrato de amonio férrico 0,8 g
Tiosulfato de sodio 6,8 g
Agar 15,0 g
Agua de grado reactivo 1L
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Ajustar el pH a 6,5 ± 0,1 y esterilizar a través del autoclave. Enfriar a 55 °C a 60°C;

re-ajustar el pH a 7,1 ± 0,2 y agregar los siguientes antibióticos secos por litro de
base de agar: 176 mg de sulfapiridina, 8,5 mg kanamicina, 37,0 mg ácido
nalidíxico y 150 mg cicloheximida. Después de mezclar, dispensar en cantidades
de 3 mL en placas de Petri de 50 x 12 mm. Almacenar las placas vertidas de 2 a
8°C. Descartar el medio sin usar después de 1 mes.

6.2.2. Agar de leche: este agar puede no estar disponible en forma deshidratada
y puede requerir preparación a partir de los ingredientes básicos, ver tabla 2 y
tabla 3.

Tabla 2. Mezcla A
leche descremada instantánea 100 g
Agua grado reactivo 500 mL

Tabla 3. Mezcla B
Caldo nutritivo 12,5 g
Cloruro de sodio 2,5 g
Agar 15,0 g
Agua grado reactivo 500 mL

Por separado preparar y esterilizar las mezclas A y B: enfriar rápidamente a 55°C;

asépticamente combinar las mezclas y dispensar de 20 mL a 25 mL por Caja Petri.

Nota: Los medios de cultivos se encuentran disponibles ya preparados si se

desean comprar.

6.3. INOCULACIÓN DE LAS PLACAS

6.3.1. Test presuntivo: filtrar 200 mL o menos de agua natural o hasta 500
mL de agua de piscina a través de filtros de membrana estériles. La membrana
debe estar firmemente en la base del embudo büchner. El montaje (figura 1) se
debe llevar a cabo dentro de una cabina de flujo laminar y se diseña de forma
que la solución a ser filtrada se puede introducir y filtrar bajo las condiciones
asépticas. Registrar el uso de equipos en el formato “Bitácora uso de
equipos”,
6.3.2. Colocar cada membrana después del filtrado en una caja Petri
vertida de agar M-PA modificado de tal forma que no haya espacio de aire entre
la membrana y la superficie del agar.
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Figura.1 Montaje de filtrado por membrana

Nota: todo el material a utilizar en el proceso debe ser esterilizado a una

temperatura de 121°C durante 60 minutos.

6.3.3. Pruebas de confirmación: usar agar de leche para confirmar una serie de
colonias típicas y atípicas que se presentan en el agar M-PA modificado. Trazar
una sola raya de 2 cm a 4 cm de largo sobre la colonia aislada que se presentó en
la membrana con un asa de inoculación esterilizada e inocular en una placa Petri
de agar con leche. El proceso se realiza en una cabina de flujo laminar. Registrar
el uso de equipos en el formato “Bitácora uso de equipos”, F-ME-021, versión
vigente.

La prueba de confirmación se realiza si se presenta algún tipo de sospecha en el

test presuntivo.

6.4. INCUBACIÓN

6.4.1. Test presuntivo: Incubar las placas Petri a 41,5°C ± 0,5°C

por 72 horas. Registrar el uso de equipos en el formato “Bitácora uso
de equipos”,
6.4.2. Test confirmativo: incubar las placas Petri a 35°C ± 1,0°C durante 24 horas.
Registrar el uso de equipos en el formato “Bitácora uso de equipos”,

6.4.3.
6.5. INTERPRETACIÓN

6.5.1. Test presuntivo: Típicamente las colonias de P. aeruginosa son de 0,8 a

2,2 mm en diámetro y aparecen planas con bordes exteriores livianos y centros
entre parduzcos y verdosos-negros. Contar colonias típicas, preferiblemente de
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filtros que contienen de 20 a 80 colonias. Usar una lupa de 10 a 15 aumentos

como una ayuda en el recuento de colonias.

6.5.2. Test confirmativo: La Pseudomona Aeruginosa hidroliza la caseína y

produce un pigmento difusible de color amarillento a verde.

6.6. ANÁLISIS DE PRODUCTO TERMINADO

6.6.1. Preparación de la muestra: el método para preparar la muestra depende

de las características físicas del producto a examinar.

 Productos solubles en agua: preparar una dilución 1 en 10 del producto a

examinar en solución amortiguadora de cloruro de sodio-peptona de pH 7,0, en
solución amortiguadora de fosfato de pH 7,2 o en caldo digerido de caseína y soja.
Disolver la solución y si es necesario ajustar el pH de 6 a 8. Registrar el uso de los
reactivos con sus respectivas cantidades en el formato “Control de reactivos
Kardex”,
 Productos no grasos insolubles en agua: preparar una dilución 1 en 10 en
solución amortiguadora de cloruro de sodio-peptona de pH 7,0, en solución
amortiguadora de fosfato de pH 7,2 o en caldo digerido de caseína y soja.
Suspender el producto a analizar y si es necesario ajustar el pH de 6 a 8. Para
favorecer la suspensión de sustancias poco humectables añadir un agente
tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80. Registrar el uso de los reactivos
con sus respectivas cantidades en el formato “Control de reactivos Kardex”,
 Productos grasos: disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo
esterilizado por filtración o mezclarlo con polisorbato 80 estéril (1 g por L). Mezclar
y mantener la temperatura en un baño de agua si fuese necesario. Agregar una
cantidad suficiente del diluyente precalentado para obtener una dilución 1 en 10
del producto original. Mezclar cuidadosamente manteniendo la temperatura
durante el menor tiempo para la formación de una emulsión. Registrar el uso de
los reactivos con sus respectivas cantidades en el formato “Control de reactivos
Kardex”,
 Líquidos o sólidos en forma de aerosol: transferir el producto
asépticamente a un aparato con filtro de membrana. Usar el contenido completo o
una cantidad definida de dosis fijas de cada envase analizado.

 Parches transdérmicos: retirar las láminas protectoras de los parches

transdérmicos y colocarlas con el adhesivo hacia arriba sobre bandejas de vidrio o
plástico estériles. Cubrir la superficie adhesiva con un material poroso estéril (gasa
estéril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un
volumen adecuado del diluyente que contenga inactivadores como polisorbato 80
y/o lecitina. Agitar la preparación vigorosamente por lo menos durante 30 minutos.
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Registrar el uso de los reactivos con sus respectivas cantidades en el formato

“Control de reactivos Kardex.

6.6.2. Preparación de agar cetramida: suspender 45,3 g del polvo cetramida en

1L de agua destilada que contenga 10 mL de glicerina. Llevar a ebullición y
distribuir 25 mL en placas Petri. Registrar el uso de los reactivos con sus
respectivas cantidades en el formato “Control de reactivos Kardex”,
6.6.3. Inoculación: utilizando el método de filtración por membrana, filtrar la
cantidad de producto que indica en la preparación de muestras (10 mL). Colocar
cada membrana después del filtrado en una placa Petri vertida de agar cetramida
en condiciones asépticas en una cabina de flujo laminar. Registrar el uso de
equipos en el formato “Bitácora uso de equipos”,
Para los parches transdérmicos después del filtrado, la membrana se coloca en
100 mL de caldo digerido de caseína y soja

6.6.4. Incubación: incubar a una temperatura de 30°C a 35°C durante un período

de 18 a 72 horas. En los parches transdérmicos el tiempo es de 18 a 24 horas.
Registrar el uso de equipos en el formato “Bitácora uso de equipos”,
6.6.5. Interpretación: el crecimiento de colonias indica la posible presencia de P.
Aeruginosa.

6.7. REGISTRO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO

Los análisis deben registrarse en el formato “Hoja de Trabajo Analítico –

Microbiología”,

7. OBSERVACIONES

N.A

8. SEGURIDAD INDUSTRIAL

 Durante la ejecución de un análisis es obligatorio usar el equipo de protección

personal que sea necesario: bata, gafas, guantes, tapabocas, entre otros.
 Antes de utilizar cualquier producto químico se debe tener conocimiento de la
información contenida en las Fichas de Seguridad.

Disponer de los residuos generados en el análisis de acuerdo al procedimiento

Manejo y Disposición de Residuos POS-GI-022, versión vigente.
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9. FORMATOS RELACIONADOS

 “Autorización del Personal del laboratorio”,.

 “Hoja de Trabajo Analítico – Microbiología”,.
 “Control de reactivo Kardex
 “Bitácora uso de equipos”,.
 “Manejo y disposición de residuos”, POS-GI-022,.


10. CONTROL DE CAMBIOS

CONTROL DE CAMBIOS
Fecha Realizó el cambio
Versión Descripción
(aa-mm-dd) Cargo Nombre