9213 E.

Técnica de filtro de membrana para Pseudomonas aeruginosa

1. Aparato de laboratorio Ver la Sección 9222B.1.

2. Medios de cultivo

a. Agar M-PA: este agar puede no estar disponible en forma deshidratada y puede requerir preparación
a partir de los ingredientes básicos.

L-lisina HCl 5.0 g

Cloruro de sodio, NaCl 5,0 g

Extracto de levadura 2.0 g

Xilosa 2.5 g

Sacarosa 1.25 g

Lactosa 1.25 g

Phenol rojo 0.08 g

Citrato de amonio férrico 0,8 g

Tiosulfato de sodio, Na2S2O3 6.8 g

Agar 15.0 g

Agua de grado reactivo 1 L

Ajuste a pH 6.5 ± 0.1 y esterilice en autoclave. Enfriar a 55 a 60 ° C; reajuste a pH 7.1 ± 0.2 y agregue los
siguientes antibióticos secos por litro de base de agar: sulfapiridina, * # (15) 176 mg; kanamicina, * 8.5
mg; ácido nalidíxico, * 37,0 mg; y cicloheximida, * 150 mg. Después de mezclar, dispense en cantidades
de 3 ml en placas de Petri de 50 × 12 mm. Almacene las placas vertidas entre 2 y 8 ° C. Deseche el medio
sin usar después de 1 mes.

b. Agar modificado de M-PA † # (16)

c. Agar de leche (Modificación Brown y Scott Foster):

mezcla A

Leche instantánea sin grasa ‡ # (17) 100 g

Agua de grado reactivo 500 ml

Mezcla B:
Caldo nutritivo 12.5 g

Cloruro de sodio, NaCl 2.5 g

Agar 15.0 g

Agua de grado reactivo 500 ml

Por separado prepare y esterilice las Mezclas A y B; enfriar rápidamente a 55 ° C; asépticamente

combine las mezclas y dispense 20 a 25 ml por placa de Petri.

3. Procedimiento

a. Pruebas presuntivas: filtre 200 ml o menos de aguas naturales o hasta 500 ml de aguas de piscina a
través de filtros de membrana estériles. Coloque cada membrana en una placa vertida de agar M-PA
modificado de modo que no haya espacio de aire entre la membrana y la superficie del agar. Invierta las
placas e incube a 41.5 ± 0.5 ° C durante 72 h.

Típicamente, las colonias de P. aeruginosa tienen un diámetro de 0,8 a 2,2 mm y apariencia plana con
bordes exteriores livianos y centros de parduzco a negro verdoso. Cuente colonias típicas,
preferiblemente de filtros que contienen de 20 a 80 colonias. Use una lupa de 10 a 15 aumentos como
ayuda en el recuento de colonias.

b. Pruebas de confirmación: use agar con leche para confirmar una cantidad de colonias típicas y
atípicas. Hacer una sola estria (de 2 a 4 cm de largo) de una colonia aislada en una placa de agar con
leche e incubar a 35 ± 1,0 ° C durante 24 h. P. aeruginosa hidroliza la caseína y produce un pigmento
difusor de color amarillento a verde.

4. Interpretación y cálculo de densidad

La confirmación no es requerida rutinariamente. En ausencia de confirmación, informe los resultados

como la cantidad presunta de P. aeruginosa / 100 ml.