INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR

DE IRAPUATO.

INGENIERÍA BIOQUÍMICA. 5°A.

Bioquímica del Nitrógeno y Regulación Genética.

Unidad 4: Replicación de ADN.

Actividad: Reporte de extracción de ADN de levaduras.

PROFESORA: Varinia López Ramírez.

Integrantes:
Diana Ivonne Meléndez Laguna, LIS19110675.
Claudia Estela Ramírez Ramírez, LIS19110120.
Marisol Ramírez Rodríguez, LIS19111462.

08 de octubre de 2021.
 -ÍNDICE-
1.Introducción....................................................................................................................... 3
2. Hipótesis........................................................................................................................... 3
3.Objetivo general.................................................................................................................4
4. Objetivos específicos.........................................................................................................4
5. Metodología...................................................................................................................... 4
5.1. Materiales................................................................................................................... 4
5.2. Metodología................................................................................................................4
6. Resultados y discusión...................................................................................................... 5
6.1. Resultados.................................................................................................................. 5
6.2. Discusión.................................................................................................................... 6
7. Conclusiones..................................................................................................................... 7
8. Anexos.............................................................................................................................. 8
Anexo 1. Diagramas de flujo.............................................................................................8
Anexo 2. Descripción de las soluciones utilizadas...........................................................10
Anexo 3. Fotos tomadas durante la práctica de obtención de ADN.................................11
9. Referencias......................................................................................................................13

-Tabla de imágenes-
Imagen 1. Electroforesis en gel de agarosa en el carril 5.......................................................5
Imagen 2. Electroforesis en gel bajo luz ultravioleta.............................................................6
Imagen 3. Cepa seleccionada para la obtención de ADN Yarrowina lipoytica...................11
Imagen 4. Muestra después de la agregación del buffer TX y mezclarse durante 5 segundos
en vortex................................................................................................................................11
Imagen 5. Muestra después de la centrifugación, donde podemos observar una separación
en donde existe el sólido de la misma muestra y el líquido, el cual contiene el "suero" en
donde se encuentra el ADN..................................................................................................12
Imagen 6. Muestra completada de Yarrowina lipoytica, donde podemos ver un ligero punto
blanco en el fondo, el cual contiene material genético que después de eliminar el suero
pasará a electroforesis...........................................................................................................12

Fecha de realización de práctica experimental: 30 de septiembre de 2021.

1. Introducción.
La técnica de electroforesis la cual es una técnica empleada para la separación de ADN y
ARN esta fue, y sigue siendo, una herramienta primordial para el desarrollo de las técnicas
del ADN recombinante o ingeniería genética. La idea de utilizar la técnica de electroforesis
a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un
bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, este nos establece que la técnica se basa
en que las muestras son sometidas a un campo eléctrico, la carga neta negativa del ADN y
el ARN hará que estos se muevan en dirección al ánodo. Si se fuerza a los ácidos nucleicos
a moverse a través de un gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la
agarosa, la fricción hará que las moléculas de mayor tamaño migren con más lentitud,
mientras las de menor tamaño avanzan más en el gel, permitiendo que las diferentes
moléculas se separen en función de su tamaño. Del mismo modo, moléculas de ADN o
ARN con topologías o estructuras tridimensionales diferentes también se comportarán de
forma diferente ante la fricción con la malla del polímero, permitiendo su separación.
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosomal que son capaces de replicar el
cromosoma, la mayoría de los plásmidos en levaduras y bacterias estos son circulares, se
encuentran distribuidos en bacterias, pero usualmente se encuentran en levaduras el cual es
nuestro caso. La extracción consiste en separar el ADN de otros componentes celulares
(como la membrana o las proteínas he incluso macromoléculas) con el fin de poder ser
estudiado o manipulado.
La extracción y purificación de ADN a partir de una muestra de la levadura Yarrowina
lipolytica (YP30) , esta es una levadura no patógena que puede utilizar hidrocarburos y
diversas grasas como fuentes de carbono. A menudo se aísla de alimentos, como el queso y
las salchichas, o de entornos naturales, como los campos petrolíferos. Yarrowina
lipolytica está relacionada muy lejanamente con otras levaduras; en cambio, comparte
varias propiedades con los hongos filamentosos por lo cual constantemente es necesario
conocer el ADN de estas para poder llegar a modificarlas o tener una variante de estas el
cual sea mejorado.
Este proceso se da gracias a la ruptura de la membrana celular el cual libera los
componentes de la levadura por medio de una lisis en la membrana celular para poder ser
estudiados cabe aclarar que el genoma de Yarrowina lipolytica está compuesta por 24
conjuntos de genoma, un recuento medio de proteínas de 6764 y un (Mb) de 202681.
(Kurtzman .P 2001)

2. Hipótesis.
Lograr una extracción eficiente de ADN de la levadura Yarrowina lipolytica, el cual se verá
plasmado en los resultados de electroforesis.
3. Objetivo general.
 El alumno aprenderá a la correcta preparación de una muestra de la levadura
Yarrowina lipolytica (YP30) mediante la agregación de diferentes reactivos para
poder generar la extracción de su ADN mediante la técnica de electroforesis.

4. Objetivos específicos.
 Aplicar los principales pasos para la obtención de ADN genómico a partir de una
muestra de levadura.
 Realizar la lisis celular mediante un tratamiento químico para la extracción del
ADN en YP305 con una solución de fenol cloroformo.
 Separar la molécula de ADN mediante la técnica de electroforesis en gel.

5. Metodología.
5.1. Materiales.
 Micropipetas (20-200 uL, 100-1000 uL).
 Caja con puntas amarillas (estériles).
 Caja con puntas azules (estériles).
 Vortex.
 Microcentrífuga.
 Gradillas para tubos Eppendorf.
 3 tubos eppendorf de 1.5 mL limpios y estériles.
 10 mL de agua de ampolleta.
 Cultivos frescos de levadura en medio líquido.
 Hielo.
 Etanol absoluto.
 Fenol:cloroformo-alcohol isoamílico.
 Regulador STES.
 TE (1X, pH 7.6).
 Etanol al 70% (v/v).

5.2. Metodología.
La metodología para realizar la extracción de ADN fue la siguiente:
Primero se nos entregó el material, en el cual venía un tubo eppendorf con 1.5 mL de
cultivo de levadura YP305. A ese tubo se le adicionó con una micropipeta 100 uL de
regulador STES y, posteriormente, con ayuda del vortex se mezcló durante unos segundos
hasta crear una mezcla homogénea. Luego se añadió 40 uL de TE (1X, pH 7.6) a la muestra
y se agitó por unos segundos en vortex hasta obtener nuevamente una mezcla homogénea.
Después se añadió 200 uL de solución fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y se
agitó en vortex unos segundos e inmediatamente se llevó a la centrífuga durante 5 minutos.
Una vez que salieron de la centrífuga, con ayuda de la micropipeta se transfirió la fase
acuosa a otro tubo eppendorf (fueron como 80-90 uL de fase acuosa), en donde se le
adicionó aproximadamente la misma cantidad de volumen en etanol absoluto y se dejó en
baño de hielo por 15 minutos. Después, este se llevó a centrifugar por 10 minutos.
Posteriormente, con una micropipeta se retiró el etanol añadido con cuidado de no interferir
con el precipitado y, después, se añadió 200 uL de etanol al 70% (v/v) y esto mismo se
llevó a centrifugar 1 minuto. Por último, se removió el sobrenadante con una micropipeta y
se dejó secar el tubo, para posteriormente, la maestra hacer el paso de la electroforesis.

6. Resultados y discusión.
6.1. Resultados.

Imagen 1. Electroforesis en gel de agarosa en el carril 5.

Electroforesis en gel de agarosa en el carril 5, realizada en la levadura (Yarrowina

lipolytica) YP30 en las cual solo se muestran ligeros índices de ADN en la parte superior y
en la parte inferior ARN.
Nuestra muestra presento un barrido desde aproximadamente 600bp hasta el marcador
aproximado a 1000pb esto nos indica que nuestra muestra no logro sacar un gran contenido
genético en el ADN donde apenas este se nota visible en los marcadores, sin embargo, si en
la recolección de ARN este es más notoria. Recordemos que el peso molecular de
Yarrowina lipoytica es de 20.5Mp así que comparándolo con lo obtenido en la muestra este
índice es bajo.
Imagen 2. Electroforesis en gel bajo luz ultravioleta.

Electroforesis en gel bajo luz ultravioleta en esta imagen podemos observar un poco mas
claramente los resultados del ARN y ADN en el carril 5.

6.2. Discusión.
Los resultados anteriores se obtuvieron mediante la lisis celular, el cual consiste en romper
partes de la pared celular o la célula completa para liberar macromoléculas como agua,
ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos y moléculas orgánicas, esto con ayuda del regulador
STES.
Al tener liberadas las macromoléculas, se procedió a añadir la solución TE(1X, pH 7.6).
Esta solución amortiguadora, ayuda principalmente a proteger el ADN y ARN inactivando
las ADNasas y ARNasas, de esta manera, al tener ambas enzimas inactivas, no se cataliza
la rotura fosfodiéster para ambos ácidos nucleicos.
Posteriormente, se añadió la solución fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) para
eliminar impurezas, es decir, eliminar restos de componentes celulares como residuos
lípidos, proteínas, sales y entre otros restos que no se necesitan en la muestra, ya que sólo
se necesita el ADN aislado sin nada de los componentes celulares que lo acompañaban
desde un inicio.
Por último, las soluciones de etanol absoluto y etanol al 70% (v/v) ayudaron a precipitar el
ADN para posteriormente llevarlos a la fase final, la cual fue a la electroforesis.
Al realizar los pasos de la metodología y con ayuda de las soluciones descritas, se
obtuvieron los resultados anteriores indicados por un rectángulo rojo. En estos se puede
observar que en la parte inferior se muestra el ARN de la muestra y en la parte superior se
muestra el ADN.
Como podemos observar, comparándolo con el marcador, en nuestra muestra hubo una
cantidad similar de ARN del marcador, mientras que, con el ADN, esta tuvo pequeños
indicios de ella.
De acuerdo con las imágenes obtenidas de la electroforesis, los resultados no fueron los
esperados, ya que al analizar la imagen 1 y 2, se puede observar que, principalmente, el
ADN no se observó de manera correcta en comparación con el marcador (que es con el cual
se comparó la muestra).
Estos resultados no tan eficientes que se obtuvieron pudieron ser causados por errores al
realizar la práctica. Por ejemplo, en los pasos de lavado y decantación, en estos se pudieron
haber llevado parte del precipitado importante a analizar, ya que, cabe recalcar, que cuando
se realizó el decantado, este se hizo mediante una micropipeta y como no se tuvo la
precisión exacta, puede que se haya extraído por error parte de este.
Esto nos lleva a reflexionar que es necesario mejorar la decantación y realizarla
preferiblemente sin usar la micropipeta. Además, mejorar el uso de las micropipetas para
tratar de extraer la menor parte de nuestro precipitado, así como, añadir correctamente las
soluciones al tubo que se fueron utilizando en cada paso de la metodología.

7. Conclusiones.
Después de seguir el protocolo para la extracción de ADN en levaduras, particularmente la
cepa YP30, se logró separar dicha molécula visualizada en la imagen 2. Al comparar
nuestro resultado con el indicador señalado en la parte izquierda, podemos notar que
nuestros resultados no fueron los óptimos probablemente a un error de decantación, lo que
nos llevó a quedar con solo una pequeña parte del precipitado insuficiente para una mejor
señal en la electroforesis.
Concluyendo, se consiguió la separación del ADN después de lisis celular prosiguiendo con
la electroforesis. Si comparamos con el marcador, podríamos indicar de mejor manera el
ARN, pero en cuestiones de ADN podemos suponer que la extracción realizada se fue
perdiendo en la decantación o en otro dado caso, lo extraído no fue suficiente para ver los
resultados de ADN en la electroforesis.
Por lo tanto, no se cumplió la hipótesis planteada por los errores descritos anteriormente.
8. Anexos.
Anexo 1. Diagramas de flujo.
 Diagrama de flujo de Marisol Ramírez Rodríguez:
 Diagrama de flujo Claudia Estela Ramírez Ramírez:

 Diagrama de flujo Meléndez Laguna Diana Ivonne:

Anexo 2. Descripción de las soluciones utilizadas.
TE (IX, pH 7.6).
Composición:
Buffer Te [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)].
Uso:
El buffer TE 10:1 es una solución amortiguadora del pH comúnmente empleada en
biología molecular, especialmente para procedimientos que buscan proteger al DNA o
RNA. La capacidad amortiguadora del buffer depende del Tris, mientras que el
EDTA es el responsable de proteger a los ácidos nucleicos inactivando a las DNAsas
o RNAsas. El EDTA logra esta inactivación actuando como quelante de cationes
divalentes como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales son indispensables para el funcionamiento de
las enzimas citadas. El pH del buffer es ajustado con HCl dependiendo del tipo de ácido
nucleico que se quiera proteger, siendo el óptimo para ARN de 7.5 mientras que para el
ADN es de 8.0.
Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1).
Composición:
Mezcla grado biología molecular de Fenol : Cloroformo : Alcohol Isoamílico (25:24:1 v/v),
pH 8.05 a 8.35, libre de niveles interferentes de metales pesados y antioxidantes.
Uso:
Es un premezclado con alcohol isoamílico (25:24:1), es decir, una mezcla saturada de
fenol : cloroformo 1:1 es ideal para la extracción de proteínas en preparaciones de ADN.
Envasado a pH 6.7, este producto se acompaña de un tampón alcalino separado que permite
incrementar el pH a 8.0.
Además, el cloroformo desnaturaliza las proteínas, elimina los lípidos y solubiliza el fenol.
Esto favorece la separación de los ácidos nucleicos que se mantienen en la fase acuosa. El
alcohol isoamílico se agrega como antiespumante en el proceso de mezclado de las fases.
Regulador STES.
Composición:
0.2M Tris-Cl pH 7.6 – 0.5M NaCl – 0.1% p/v SDS – 10mM EDTA pH 8.0
Uso:
La solución Tris se utiliza durante la lisis celular, la eliminación y la precipitación de
componentes celulares no deseados para mantener un pH estable.

Etanol absoluto.
Conocemos como alcohol absoluto (o alcohol deshidratado, o etanol absoluto). No contiene
agua y su pureza está cercana al 100%, es incoloro, transparente, volátil e inflamable, se
utiliza como disolvente, para uso químico.
Etanol al 70% (v/v).
Composición:
Cada 100 ml contiene 73.4 de etanol al 96% y agua desmineralizada.
Uso:
Es un buen disolvente, y puede utilizarse como anticongelante. También es
un desinfectante. Su mayor potencial bactericida se obtiene a una concentración de
aproximadamente el 70 %, ya que se reduce la tensión superficial de la célula bacteriana,
facilitando el proceso de desnaturalización proteica.

Anexo 3. Fotos tomadas durante la práctica de obtención de

ADN.

Imagen 3. Cepa seleccionada para la obtención de ADN Yarrowina lipoytica.

Imagen 4. Muestra después de la agregación del buffer TX y mezclarse durante 5
segundos en vortex.

Imagen 5. Muestra después de la centrifugación, donde podemos observar una separación

en donde existe el sólido de la misma muestra y el líquido, el cual contiene el "suero" en
donde se encuentra el ADN.
Imagen 6. Muestra completada de Yarrowina lipoytica, donde podemos ver un ligero
punto blanco en el fondo, el cual contiene material genético que después de eliminar el
suero pasará a electroforesis.

9. Referencias.
Laboratorio de Genómica Viral y Humana. (2008). Preparación de Buffer Tris 10 mM-
EDTA 1mM (TE 10:1). Facultad de Medicina UASLP. Obtenido de:
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Mol_Buffer_TE_SPA.pdf
Barrantes-Bustinza, W. I. (2000). Guía de prácticas: Biología Molecular. Universidad
Nacional Federico Villarreal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas.
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular. Lima, Perú. Obtenido de:
http://www.bioquimica.ucv.cl/paginas/central/biologia/GU%20I%20A%20DE
%20PRACT%20I%20CAS%20de%20biologia%20molecular.pdf
Instituto Nacional del Cáncer. (s.f.). Definición de Lisis. Obtenido de:
https://www.cancer.gov/espanol/publicaciones/diccionarios/diccionario-cancer/def/
lisis
Universidad Complutense de Madrid. (s.f.). ¡¡Podemos ver el ADN!! Obtenido de:
https://www.ucm.es/data/cont/docs/1462-2017-10-18-3.1%20DNA%20extr_es.pdf
Alejos-Velázquez, L. P., Aragón-Martínez, M. C., & Conejo-Romero, A. (s.f.). Extracción
y Purificación de ADN. Obtenido de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
BIOCELL SCIENCE. (s.f.). Mezcla de Fenol: Cloroformo: Alcohol iso-Amílico (25:24:1)(v/v/v).
Obtenido de: https://biocellsci.com/portfolio_page/mezcla-de-fenol-cloroformo-
alcohol-iso-amilico-25241-v-v-v/
Rojas, L., Portal, O., & Jiménez, E. (2011). Extracción de ARN total en plantas y hongos
filamentosos. Biotecnología Vegetal, 11(4). Recuperado
de https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/256/838-

Tan, A. (2018). ¿Cuál es la función de una solución buffer Tris en la extracción de ADN?
Recuperado de Geniolandia el 7, octubre 2021 Sitio web:
https://www.geniolandia.com/13121238/cual-es-la-funcion-de-una-solucion-buffer-
tris-en-la-extraccion-de-adn
Kurtzman .P, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts y P. Walter.
(2001) Introducción a la Biología Celular. 2ª Edición. Editorial Médica
Panamericana.
J. Luque, y A. Herráez (2001) Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ediciones
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