Práctica N3: Identificación de Protozoarios Sanguíneos y tisulares

FROTIS DE SANGRE PERIFERICA Y GOTA GRUESA

OBJETIVO

• Preparar una muestra de sangre para su estudio microscópico, comprobando la presencia o ausencia de parásitos
hematológicos en ella, durante el proceso de observación

FUNDAMENTO

• La preparación de gota gruesa es un tipo de técnica que se utiliza para el estudio de parasitosis en sangre, como las
distintas especies de Plasmodium, responsables de la Malaria o Paludismo, y para la identificación de distintas especies
de Trypanosoma Trypanosoma cruzi agente responsable de la enfermedad de Chagas)

Tipos de diagnósticos (para la investigación de estas enfermedades):

 Epidemiológico (ver si el paciente vive en lugares endémicos o de riesgo a contagio)

 Clínico (revisar sus signos y síntomas)
 Laboratorio (estudio de laboratorio para identificar la enfermedad)

¿Cuál es el Objetivo?

La extensión fina se realiza para confirmar un diagnóstico de malaria, prestando atención en los hematíes infectados y
en los parásitos que hay dentro de ellos. (ESTADIOS PARASITARIOS)

La gota gruesa se observa la morfología de los parásitos, ya que son más abundante que en la extensión y más
compactos. (se usa la sangre capilar, punción de dedo)

La diferencia que existe en ambas es que en la gota gruesa podemos observar mas elementos, y su ventaja, la gota
gruesa es más rápida de aplicar, es útil es casos leves, una desventaja es que ocupa tener experiencia.

CELULAS SANGUIENEAS:

 Linfocitos (20% a 40%)

 Monocitos (2% a 8%)
 Basófilos (0.5% a 1%)
 Granulocito basófilo
 Granulocito eosinófilo
 Neutrófilos (40% a 60%)
 Eosinófilos (1% a 4%)
MALARIA

Vector: Anopheles albimanus

En esta especie tenemos MACHO y HEMBRA, la diferencia de ambos es la antena del

macho es mas peluda que la hembra, y la que va a picar seria la hembra.

Examen microscópico: Se hace por gota gruesa y extendido, teñidos con los
colorantes derivados del Romanowsky, como son Giemsa, Wright, Leishman y Field

a) Gota gruesa: Este procedimiento es más eficaz que el extendido, pues permite visualizar mayor número de
parásitos, por la mayor cantidad de sangre que se estudia. Es necesario lisar los glóbulos rojos para permitir la
visualización de los parásitos ( IDEA PARA PARASISTEMIAS LEVES)

Como los eritrocitos se han destruido, no se puede establecer su relación con el parásito La observación de trofozoítos
pequeños en anillo, como únicas formas, sugiere infección por Plasmodium falciparum y la presencia de trofozoítos y
esquizontes orienta hacia el diagnóstico de otras especies(NO IDEAL PARA PARASISTEMIAS LEVES)

Elementos formes de la sangre en la gota gruesa

 Restos de glóbulos rojos

 Leucocitos
 Plaquetas o trombocitos
 Parásitos si los hay

b) Extendido: Este método facilita la observación del detalle morfológico de los parásitos y su relación con los
eritrocitos, por lo tanto, permite confirmar con mayor certeza la especie de Plasmodium En parasitemias bajas
este examen puede ser negativo, mientras que la gota gruesa puede ser positiva

Elementos formes de la sangre en el extendido fino

 Glóbulos rojos
 Leucocitos
 Plaquetas
 Parásitos si los hay (añadió el lic)

c) Reacciones inmunológicas

Los métodos serológicos más empleados son

 Inmunofluorescencia directa
 ELISA
 FAST ELISA
 Hemaglutinación indirecta
Plasmodium vivax:

 Trofozoíto presenta un núcleo o cromatina que se tiñe de color rojo y un citoplasma que se tiñe de color azul.
Una vez que madura el trofozoíto se convierte en trofozoíto ameboide, luego el trofozoíto ameboide madura y
se convierte en Esquizonte.
 Esquizonte, en su interior contiene a los merozoitos, también se observa el pigmento malárico que es la
hemoglobina no digerida del parasito, luego el esquizonte se convierte en gametocito
 Gametocito diferenciado en macho y hembra, si es macho la cromatina se encontrará difusa y su citoplasma
redondeado y si es hembra, la cromatina estará mas compacta y su citoplasma es redondeado

Plasmodium falciparum:

 En el trofozoíto se va a observar una múltiple parasitación, puede haber dos o tres trofozoítos dentro de un
mismo glóbulo rojo, su núcleo o cromatina se tiñe de color rojo y su citoplasma que se tiñe de color azul, a
demás tendremos la presencia del gametocito.
 El gametocito se diferencia en macho y hembra, si es macho tendrá una forma de banana o forma de salchicha,
su cromatina difusa, y si es hembra también tendrá la forma de banano o salchicha pero su cromatina mas
compacta.

ENFERMEDAD DE CHAGAS (Tripanosomiasis americana)

Agente causal: (Chinche comunmenten conocida)

 Trypanosoma cruzi

Vectores:
  Triatoma dimidiata (Hembra, abdomen en punta; macho, abdomen redondeado) esta genera los artrópodos
 Rhodnius prolixus (Erradicado en el país)
 Pastrongylus sp.

En la enfermedad de Chagas podemos observas tres estadios:

 Tripomastigote (meta cíclico y sanguineo)

 Epimastigote (único que se puede aislar en cultivos)
 Amastigote (único que se puede aislar en tejido cardiaco, Cardiopatía, aumentan el tamaño del corazón)

Nota:

Tripanosomiasis africana, la enfermedad del sueño

Agente causal: Trypanosoma brucei gambiense en las regiones occidental y central de África y por T. brucei rhodesiense
en la región oriental de África; transmitidos por la picadura de la mosca tsetsé.

Diagnóstico

El diagnóstico es de acuerdo a la fase de la infección en que se encuentre el paciente

 Fase aguda
 Fase latente
 Fase crónica
1. Métodos parasitológicos directos (período de parasitemia en la fase aguda de la infección) (LEVE)
 Examen en fresco
 Extendido coloreado
 Gota gruesa
 Recuento de Tripanosomas
 Métodos de concentración
 Biopsia (ganglio linfático)

 Examen en fresco: Tiene por objeto visualizar el tripomastigote en una gota de sangre entre lámina y laminilla
Tiene una sensibilidad en la fase aguda de un 90 pero en la crónica la sensibilidad es menor del 10. Se debe de
observar en menos de 1 min, se observará los tripomastigotes sanguineos
 Extendido coloreado: Los extendidos delgados o frotis de sangre o plasma, se pueden colorear con los derivados
de Romanowsky, especialmente Giemsa Su sensibilidad para el diagnóstico es menor del 60 en la fase aguda, se
observará los tripomastigotes sanguineos
 Gota gruesa: La misma técnica empleada para malaria se utiliza en la tripanosomosis Este método permite
estudiar un mayor volumen de sangre y es más útil que el extendido, cuando la parasitemia es baja y su
porcentaje de sensibilidad llega hasta el 70 en la fase aguda, se observará los tripomastigotes sanguineos
 Biopsia: para observar nidos de amastigotes

 Recuento de tripanosomas: En algunas ocasiones se requiere hacer recuento de parásitos por mm 3 de sangre,
con el fin de evaluar el grado de parasitemia
 Métodos de concentración: Se han propuesto varias técnicas para concentrar tripomastigotes El procedimiento
más usado es el de Strout que tiene una sensibilidad de 90 a 100 en la fase aguda, pero no llega al 10 en la
crónica Se obtiene sangre por punción venosa para colocar en un tubo de ensayo sin anticoagulante Se deja
retraer el coágulo y los tripomastigotes salen hacia el suero, el cual se centrifuga para obtener una mayor
concentración
Otra forma de concentrar es mediante el uso de tubos capilares con heparina o sangre venosa citratada, de la cual se
separan los glóbulos rojos por sedimentación espontánea o centrifugación Los parásitos salen al plasma sanguíneo y se
pueden observar al microscopio,

2. Métodos parasitológicos indirectos (parasitemia baja en la fase crónica)

 Xenodiagn óstico (alto índice de sensibilidad)
 PCR
 Cultivos (el mas utilizado en la actualidad es el medio de LIT (Liver Infusion_Tryptose, NNN (Novy MacNeal
Nicolle) (alto índice de sensibilidad)
 Inoculación en animales
3. Procedimientos serológicos (Fase latente y crónica de la infección, difícil encontrar los parásitos) SE INVESTIGAN
ANTICUERPOS, la mayoría de pacientes cuando la consultan ya llegan en la etapa crónica de la enfermedad
 Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
 Prueba de ELISA (Se usa más en EL SALVADOR, Anticuerpos para CHAGAS, nombre del Examen)
 Hemaglutinación indirecta
 Fijación del complemento
 Prueba del látex
 Aglutinación directa

Prueba de Xenodiagnostico:
Consiste en utilizas las ninfas del segundo o tercer estadio creadas en
laboratorio, son ninfas que han sido alimentadas con sangre de gallina
india, al momento de la prueba se usan ninfas con un periodo de ayuno
de 7 dias hasta 15 dias, se colocan hasta 10 ninfas en un frasco, se le
coloca en el antebrazo al paciente para que puedan succionar la sangre
para investigar si el ser humano tiene presencia de chagas, una semana
después esas chinches son incubadas y analizadas, se oprime el
abdomen para obtener las heces del vector, aquí se observaran 2
estadios, tripomastigotes metacíclico y epimastigote (el uncico que se
ha podido aislar de los tres estadios)
Cultivo:
El más utilizado en la actualidad es el medio de LIT (Liver
Infusion_Tryptose, NNN (Novy MacNeal Nicolle)
Se observan los Epimastigotes

Tripomastigote observado en un frotis de sangre periférico, que

presenta una membrana ondulante, flagelo, núcleo, quinetoplasto
 En las heces del vector

Nidos de amastigotes en el tejido cardiaco

Se realiza una biopsia donde se colorea con hematoxilina eosina
comúnmente usada para poder observarlos

LEISHMANIOSIS

Agente causal:

 Leishmania sp

Vector:

 Lutzomyia longipalpis (Vector más común en El Salvador)

Diagnóstico:

 Examen directo
 Biopsias
 Cultivos (medio de NNN)
 Prueba de la PCR
 Intradermorreacción de Montenegro
 Métodos serológicos ELISA, HEMAGLUTINACION INDIRECTA, AGLUTINACION DIRECTA

1. Examen directo: En las lesiones iniciales sin contaminación bacteriana es posible obtener una buena muestra de
aspecto granular, con células del tejido, con muy poca sangre y en donde la coloración muestra con facilidad los
amastigotes intra o extracelulares
El método clásico consiste en hacer una incisión en el reborde de la úlcera, en la lesión papular o nodular, para
luego raspar el tejido y obtener histiocitos o macrófagos parasitados, la abundancia de sangre indica que la
muestra no es ideal y se enmascara el diagnóstico, se oberva mediante una tinción de Giemsa. En un examen
directo se observará Amastigotes.
La fase infectante para el humano será: PROMATIGOTES que se encuentran en el tubo digestivo del vector
La fase infectante para el vector será: AMASTIGOTES que se encuentran en el paciente
2. Biopsia: El estudio histopatológico de la muestra tomada por biopsia permite hacer el diagnóstico en muchos
casos, al observar la presencia de amastigotes intracelulares
 3. Cultivos: El medio más empleado es Novy MacNeal Nicolle, conocido comúnmente como medio NNN También
se emplean otros como Tobie modificado, medio de Senekjie y el medio de Drosofila de Schneider, comúnmente
se observarán los PROMASTIGOTES, existe un crecimiento de ellos, se encuentran en el tubo digestivo del
vector, y es el único que se va a aislar en cultivo.

La incubación se hace a temperatura ambiente entre 2020°C y 3030°C, después de 8 días se revisan los cultivos para
buscar los promastigotes en la fase líquida, que con frecuencia están aglomerados y entrelazados por los flagelos,
formando algunas rosetas que son características

4. Prueba de la PCR
5. Intradermorreacción de Montenegro: es una prueba parecida a la de la tuberculina. Es un método indirecto para
el diagnóstico de la leishmaniosis y corresponde a una reacción de hipersensibilidad tardía, conocida con el
nombre de prueba de Montenegro o leishmanina Consiste en la aplicación de un antígeno compuesto por
suspensión de promastigotes procedentes de cultivos Estos parásitos fenolizados se aplican intradérmicamente
al paciente y entre 48 y 72 horas se hace la lectura Es positiva si se palpa un nódulo inflamatorio de 5 mm o más,
semejante al observado con la tuberculina La prueba aparece positiva después de 1 a 3 meses de haber
adquirido la infección y permanece así indefinidamente, aun después de haber curado las lesiones

Se midan los nódulos inflamatorios, en la prueba de Intradermorreacción de

Montenegro

Se diferencian del tripomastigote sanguíneo por no presentar una membrana

ondulante

Nidos de amastigotes infectas los macrófagos o histiocitos

Video Refuerzo:

GOTA GRUESA O EXTENDIDO

El examen de Gota Gruesa es el método diagnóstico más ampliamente difundido para el diagnóstico de la malaria y el
recomendado como primera opción en el proceso diagnóstico.

La gota gruesa consiste en examinar al microscopio una gota de sangre obtenida mediante punción digital de un dedo de
la mano o del pie sobre una lámina portaobjetos.

El examen microscópico permite identificar formas y características parasitarias y presencia o ausencia de

granulaciones del glóbulo rojo.
Con el conjunto de hallazgos se logra diagnosticar tanto el género plasmodium como las especies implicadas en la
infección y determinar la parasitemia.

Realizada de forma adecuada la gota gruesa tiene mayor sensibilidad que el extendido y que las pruebas rápidas.

El examen de gota gruesa es el método diagnóstico más ampliamente difundido para el diagnóstico de la malaria y el
recomendado como primera opción en el proceso diagnóstico.

La gota gruesa consiste en examinar al microscopio una gota de sangre obtenida mediante punción digital de un dedo de
la mano o del pie sobre una lámina portaobjetos.

La toma de muestras debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia y antisepsia y bioseguridad.

Las láminas de vidrio a emplear deben limpiarse meticulosamente con agua y jabón y luego desengrasarse con alcohol.

La toma de la muestra puede hacerse a partir de la sangre anticoagulado o a partir de punción capilar.

Si se opta por la punción capilar se utiliza el dedo índice de la mano dominante del paciente buscando la parte
intermedia del dedo lejos de la uña y no tan cerca del pulpejo.

Es recomendable tomar la muestra o repetirla durante unas horas después de la fiebre.

Al pulsar se debe eliminar la primera gota de sangre porque puede estar hemo diluida.

Se deposita la gota de sangre sin tocar la incisión para no promover la coagulación por cada paciente se recomienda usar
dos láminas cada una con dos gotas gruesas y una lámina de extendido.

Una forma de hacer la gota gruesa es en forma de “n” se deja que la muestra se extienda por capilaridad con la mano se
arrastra hacia arriba luego se baja de manera inclinada como dibujando una n y se vuelve a ascender hasta completar un
cuadradito de un centímetro por un centímetro distribuyendo la sangre de forma homogénea.

La otra forma es colocar la muestra en el centro se parte la muestra por la mitad dejando que se extienda y con la lámina
extensor a subimos luego bajamos regresamos al centro y homogenizamos.

La muestra se deja secar antes de utilizar el colorante se hace un proceso de pre coloración con azul de metileno
fosfatado para deshemoglobinizar, es decir, para destruir los glóbulos rojos, pues lo que se busca es que se vea el fondo
homogéneo con los parásitos libres.

Se introduce la lámina en una solución de azul de metileno por unos segundos, se saca y se la va usando solución buffer,
no agua, cuidando que la muestra no se desprenda ya que ésta a diferencia del extendido no se fija.

En la gota gruesa se concentra entre 20 a 30 veces el número de capas de glóbulos rojos y se considera unas 15 veces
más sensible que el extendido, esto en virtud de la mayor cantidad de sangre por área examinada y porque estando los
parásitos libres es posible visualizar más parásitos por área que en la misma muestra esa mirada por extendido.

Se utiliza una lámina cóncava y se prepara la solución de coloración, podemos utilizar Romanowsky, Romanowsky
modificado, Field Giemsa y de Wright, que tienen colorantes ácidos (eosina) y básicos (azul de metileno, azul I y azul II)
que colorean los componentes celulares acidofilicos y Basofílicos respectivamente.

En el caso de plasmodium, el citoplasma se colorea azul, la cromatina núcleo se colorea rojo y el pigmento malárico
pardo amarillo.

Se coloca la muestra boca abajo porque eso ayuda en el proceso de deshemoglobinización.

La lámina se sumerge en la coloración unos 15 a 20 minutos cuando pase el tiempo se levanta la lámina sin lavarlas
porque se puede desprender la muestra y la ponemos a secar.
Se examina la gota gruesa teniendo cuidado de no confundir artefactos o plaquetas sanguíneas con parásitos de malaria,
lo que puede llevar a un diagnóstico equivocado y a ignorar posibles diagnósticos diferenciales.

Para considerar el examen de gota gruesa como negativo es necesario que hayan sido leídos al menos 200 campos
microscópicos.

En general se recomienda que ante un caso probable de malaria con gota gruesa negativa el examen debe ser repetido
dentro de las siguientes 24 horas, esto es especialmente importante en situaciones donde pueda tratarse de infección
por Plasmodium falciparum.

En casos en que los parásitos son secuestrados en los capilares en un 50% del ciclo eritrocitos y por lo tanto no siempre
están presentes en la sangre periférica.

Otras razones frecuentes para no encontrar parásitos cuando el cuadro clínico es sugestivo de malaria son que el
paciente haya tomado antimaláricos o que los parásitos sean escasos como para ser detectados en sangre periférica.

El hallazgo de muy escasas formas compatibles con parásitos debe ser debidamente explicado por escrito en el reporte
del laboratorio.

El diagnóstico basado en el hallazgo de parasitemia es muy bajas debe ser confirmado.

Cuando se detecte en menos de 100 parásitos por microlitro es decir el equivalente a 2 a 3 parásitos en toda la placa
debe repetirse la lámina en un periodo de 8 a 12 horas.

En tales circunstancias reportar una lámina como positiva sin informar el reducido número de formas parasitarias que
fueron observadas pueden llevar a un médico no familiarizado con la malaria a desconocer otros diagnósticos
diferenciales y retardar el adecuado manejo de otra patología, lo que puede tener consecuencias lamentables.

Cuando se realiza la toma de muestra de la gota gruesa se hace también la del extendido.

Elabore el extendido en una lámina independiente de la gota gruesa debido a que el procedimiento de coloración de las
dos muestras difiere y el metanol, que requiere el extendido para ser vigado, daña la gota gruesa.

Para hacer el extendido se toma la muestra de sangre y se ubica sobre la lámina luego con la ayuda de otra lámina se
esparce en una posición de la lámina, como es necesario que se vean los glóbulos rojos se deja secar y se procede a fijar
con metanol.

Cuando se seque se hace el mismo proceso de coloración que se utilizó en la gota gruesa en la lámina cóncava puesta
boca abajo, la única diferencia es que por lo general la lámina se sumerge el doble de tiempo en la coloración que el que
se requiere en la gota gruesa, es decir, 30 minutos.

Cuando se acaba el tiempo separa la lámina dejando que se seque para ser observada el objetivo de inmersión.

Con ayuda del microscopio se examina el extendido a partir del segundo tercio final de la muestra donde los glóbulos
rojos no se encuentran superpuestos, esto con el fin de facilitar el recuento parasitario que está relacionado
directamente por el número de glóbulos rojos del paciente.