Práctica 1.

Antígenos de naturaleza lipídica: floculación

¿Qué es un antígeno?

Cualquier sustancia (molécula) que puede interaccionar con anticuerpos (o receptores de linfocitos
T y B) de la respuesta inmune adaptativa, un inmunógeno interacciona con anticuerpos o receptores
de los receptores de la respuesta inmune adaptativa pero también genera los mecanismos
necesarios para producir anticuerpos y activa la proliferación de linfocitos T y B. Un antígeno puede
ser una proteína (con epítopos que puedan interaccionar con anticuerpo), un polisacárido o un
lípido.

Cualquier molécula considerada antígeno puede interaccionar con receptores de linfocitos T o B, en

caso de ser un inmunógeno los linfocitos B se convertirán en células plasmáticas para producir y
secretar anticuerpos

Dependiendo de la naturaleza del antígeno, la respuesta inmune (producción de anticuerpos)

tendrá dos rutas:

● Antígenos T dependientes: Se requiere de la participación de linfocito T cooperadores para

producir anticuerpos. Requieren del estímulo de células Th2 para la producción de
anticuerpos, Antígenos proteicos, Generan memoria inmunológica, Inducen IgM, IgA, IgG,
IgE. Para la activación de un linfocito la primera señal es la interacción del MHC-TCR con el
antígeno, la segunda señal es el correceptor CD40/CD40L y una tercera señal, el linfocito T
produce citosinas que estimulan un cambio en la APC
● Antígenos T independientes: El linfocito B puede reconocer directamente un antígeno
(PAMP) y producir anticuerpos. No requieren de la participación de células Th2, Pueden
reconocer al antígeno (o PAMP) de forma directa, Polisacáridos, glicolípidos, lípidos,
proteínas, No generan memoria inmunológica, Inducen IgM. Se dice que es una respuesta
rápida la que hacen las células de la inmunidad.

Treponema pallidum:

Agente causal de la sífilis (ITS), espiroqueta 0.5 micras y 5 a 15 micras, tiene una estructura cilíndrica
en espirales, con una pared celular flexible, tiene un flagelo periplásmico que corre entre una
membrana externa y una membrana interna, hay una pequeña cantidad de peptidoglicano, es una
gram negativa.

Tiene un movimiento rotatorio que le permite invadir tejidos. No resiste condiciones de estrés (No
existe un medio de cultivo apto), la información que se conoce de esta bacteria es por medio de
análisis bioinformáticos (no hay detoxificación de ROS, no hay fuente especializada de producción
de ATP), tiene capacidad de transitar mucosas e invadir, su movilidad promueve cruce de capas
tisulares y la capacidad de atravesar la placenta.

La sífilis es una enfermedad que se desarrolla durante tiempo prolongado (años), lo primero se
evidenciará con una:

● Etapa primaria: Pápula que evoluciona a úlcera en el sitio de infección (chancro), indolora,
aumento de tamaño de ganglios linfáticos locales, indoloros, cicatrización espontánea).
 ● Etapa secundaria: 2 a 8 semanas después de cicatrización del chancro, adenomegalia no
dolorosa, fiebre, exantema en palmas de las manos, condiloma plano: lesiones verrugosas
perineales
● Etapa latente: No ha manifestaciones clínicas Puede haber reversión a la infección
secundaria hasta 30 años
● Etapa terciaria: Neurosífilis: fiebre, cefaleas, alucinaciones, sífilis cardiovascular: aneurisma
de la aorta, goma: lesiones en piel y órganos internos (con secreciones blanquecinas)

Diagnóstico:

1. Pruebas No Treponémicas: Anticuerpos contra cardiolipina (antígeno de naturaleza lipídica

que se encuentran en mitocondrias reaginas) no necesariamente pertenecen a Treponema
pallidum. Se basan en la detección de anticuerpos no treponémicos (IgM e IgG) activados
por el sistema inmune del hospedador frente a antígenos preparados con sustancias como
lecitina, colesterol o cardiolipina (DAMPS expresados por el daño que hizo Treponema), que
se liberan como resultado del daño celular producido por cualquier patología. La activación
ante estos antígenos serán T-independientes
Reacción de floculación: No precipita por la poca densidad que presenta un lípido, pero si
hay una formación de un agregado en suspensión (mezcla de complejos antígeno-
anticuerpo)

Los anticuerpos que se pretenden identificar son obtenidos a partir del suero de un
paciente.
● Reagina plasmática rápida
● VDRL
2. Pruebas Treponémicas: Uso de anticuerpos específicos para Treponema marcados con
fluorocromos (FITC)
● Inmunofluorescencia
 Práctica 2. Reacción de aglutinación pasiva: factores
reumatoides.
Las reacciones de aglutinación se emplean para determinar la presencia de anticuerpos en una
muestra al mezclarla con antígenos particulados (sobre la superficie de una molécula o una célula).

Se forma un agregado visible entre el anticuerpo y las partículas que contiene el antígeno adsorbido.
Se requiere que el antígeno o el anticuerpo estén acoplados a una partícula acarreadora: Bacterias
Eritrocitos Látex.

Clasificación de las reacciones antígeno anticuerpo:

1. Aglutinación activa o directa: El antígeno ya se encuentra en forma natural sobre la

superficie de la célula o bacteria. Un ejemplo es el grupo sanguíneo. La aglutinación
bacteriana usa al patógeno completo como fuente de antígenos. Es posible medir los niveles
de anticuerpo producidos por un huésped infectado con el patógeno. La unión de los
anticuerpos a los antígenos en la superficie de la bacteria resulta en grumos visibles.

Un ejemplo de esta aglutinación son las reacciones febriles, las bacterias pueden tener una
gran cantidad de antígenos de diferente naturaleza en su superficie, en Salmonella typhi, el
Antígeno O se un antígeno que se compone de lipopolisacáridos, es un complejo de una
porción lipídica y una gran cantidad de carbohidratos específicos para cada tipo de mo, en
 Salmonella typhi y E.coli tienen el mismo lípido A y la parte inicial de carbohidrato, pero
difieren en la secuencia externa de carbohidratos otro ejemplo de antígeno es el Antígeno
H se encuentra en el flagelo y está determinado por la proteína flagelina. El anticuerpo IgM
anti-O aparece primero y representa la respuesta sérica inicial y la fase aguda de la fiebre
tifoiodea El anticuerpo IgG anti-H se desarrolla más lentamente, pero persiste por tiempo
prolongado, estos son ejemplos de una aglutinación activa debido a que los antígenos ya se
encuentran de forma natural en la bacteria

2. Aglutinación pasiva o inversa: El antígeno se debe colocar de forma intensional sobre la

superficie de la partícula. Es reversa si se adsorben los anticuerpos a la partícula. Emplea
partículas acarreadoras que son recubiertas con antígenos solubles. Se puede adsorber
tanto antígenos como anticuerpos, entonces las partículas (o células) se aglutinan cuando
reaccionan con su correspondiente anticuerpo o antígeno. Las partículas de látex, carbón,
sílica, son usadas como acarreadores inertes. Cuando el anticuerpo es adsorbido a la
partícula para la detección de antígenos, se le llama aglutinación pasiva reversa

3. Hemaglutinación: Los eritrocitos se les emplea como partículas acarreadoras. Es reversa si

se adsorben los anticuerpos a los glóbulos rojos. GR de oveja, humanos, pollo, etc. son
comúnmente usado en esta variación de la aglutinación. Cuando los GR son cubiertos con
antígenos (proteínas bacterianas, polisacáridos, etc) para detectar anticuerpos en el suero,
la prueba es llamada hemaglutinación pasiva ó indirecta. Cuando los anticuerpos se unen a
los GR para detectar antígenos microbianos, se le conoce como hemaglutinación pasiva
reversa.
 Artritis reumatoide:

Una enfermedad autoinmune que existe un descontrol sobre las respuestas inflamatorias frente
antígenos propios. Es una inflamación de la sinovial asociada a una destrucción del cartílago articular
y del hueso Los pacientes tienen con frecuencia anticuerpo IgM o IgG circulantes que reaccionan
con las porciones Fc de sus propias IgG, se les conoce como factores reumatoides.

Se han identificado linfocitos T y B que reconocen péptidos citrulinados. Hay propensión a AR ligada
a HLA-DR4

Los signos y síntomas de la artritis reumatoide pueden incluir los siguientes: Articulaciones
doloridas, calor e hinchadas, rigidez de las articulaciones que generalmente empeora a la mañana y
después de un tiempo de inactividad, fatiga, fiebre y pérdida de peso.

Los factores reumatoides se identifican mediante aglutinación pasiva empleando IgG adsorbida a
partículas de látex como antígeno

Antígenos intencionalmente puestos

FACTORES REUMATOIDES: Anticuerpos dirigidos a la porción Fc de las IgG´s propias.
Se pueden identificar anticuerpo contra ciertas proteínas que se modifican en un ambiente
inflamatorio por la desaminación de argininas (eliminación de NH2) , son anticuerpos antiproteínas
citrulinadas.

En la artritis reumatoide existe la acumulación de neutrófilos al sitio de inflamación estos se activan

para producir elastasas, ROS, proteasas, etc. Los neutrófilos sufren la formación de trampas
extracelulares de neutrófilos, estallan para liberar su ADN para poder neutralizar a los patógenos,
es un tipo de muerte celular regulada. NETs es un tipo de muerte celular en el cual se induce la
liberación de redes de cromatina en asociación con histonas, proteínas citoplasmáticas entre ellas
(PAD4), del citoesqueleto o proteínas granulares hacia el medio extracelular para atrapar y destruir
microorganismos patógenos, estas NETs pueden dañar proteínas de la matriz extracelular en
articulaciones, una enzima que hay en estas NETs es la PAD, elimina un grupo amino para poner un
grupo carbonilo, esta proteína se vuelve disfuncional y pierde su plegamiento, se vuelve un
autoantígeno, el cuerpo hace una producción de anticuerpos para destruir proteínas citrulinadas.

La detección de anticuerpos que van dirigidos a las proteínas citrulinadas es más sensibles que a
comparación de la detección de factores reumatoides, todo porque los primeros anticuerpos
aparecen de forma más temprana.
 Práctica No. 3 Precipitación de complejos antígeno-
anticuerpo: inmunodifusión doble
• PRECIPITACIÓN: En esta interacción Antígeno-Anticuerpo, el antígeno se encuentra de
forma soluble. (de manera independiente, libre, no están particulados)
• Cuando el antígeno soluble reacciona con su anticuerpo específico, a temperatura y pH
óptimos y en presencia de electrolitos (fuerza iónica) se forma un complejo Ag-Ab que
precipita al ser insoluble. (tardan entre 24 horas en aparecer, pero una vez que se
encuentran Ag-Ab sucede en nanosegundos, se tarda porque al estar libres tardan en
encontrarse)
• Un látice se forma entre los antígenos y anticuerpos; en ciertos casos, es visible como un
precipitado insoluble.
• Los anticuerpos que agregan antígenos solubles se les llama precipitinas.
• A los anticuerpos que participan en la aglutinación se les conoce como aglutininas
• La formación de una red antígeno-anticuerpo depende en la valencia de ambos

El anticuerpo debe ser al menos bivalente (para dar la precipitación); no se formará precipitado son
fragmentos Fab monovalentes

La valencia se refiere al número de paratopos disponibles de un Ab para poder interaccionar con un

epítopo (los IgE, IgD e IgG tienen valencia de 2, el IgA es de 4 si es de mucosa, si es de suero tiene 2
e IgM de 5)

El antígeno debe ser bivalente o polivalente; esto es, debe tener al menos dos copias del mismo
epítopo o diferentes epítopos que reaccionan con diferentes anticuerpos presentes en un suero
policlonal.

Las reacciones de Ag-Ab también se pueden describir en función de la concentración de cada uno.

El antígeno y el anticuerpo deben estar en una concentración apropiada relativa uno del otro para
que se dé la precipitación.

1.Prozona: demasiado anticuerpo evita la formación eficiente de las redes entrecruzadas de

complejos inmunes

2.Equivalencia de antígeno y anticuerpo: Se forma una cantidad máxima de látices (precipitado)

3.Postzona: demasiado antígeno evita la formación eficiente de las redes entrecruzadas de

complejos inmunes
Cuando en un tubo se coloca en la parte inferior anticuerpos y luego en la parte superior antígenos,
los Ab comienzan a migrar hacia donde no hay por el gradiente de concentración, lo mismo pasa
con los Ag, eventualmente se van a encontrar y habrá una zona de equivalencia

La dilución va de 1 → ½ → ¼ → 1/8 → 1/16 → 1/32, en la dilución de ¼. 1/8 y 1/16 está la zona de

equivalencia

La prueba de anillo de precipitación da información acerca de las interacciones antígeno-anticuerpo

y títulos de anticuerpo, sin embargo, tiene algunas desventajas:

• Requiere grandes cantidades de suero

• Se debe tener mucho cuidado para evitar mezclar las soluciones

Al desarrollar la técnica en matrices de gel de agar puede reducir estos problemas. A continuación,
describiremos lo más comunes:

Hay muchos métodos de precipitación aplicados en el laboratorio clínico para el diagnóstico de

enfermedades y en investigación

Estos pueden ser realizados en medios semisólidos tales como agar o agarosa

Inmunodifusión en una dimensión (método de Oudin): Cuando la solución de antígeno es vertida

sobre una capa de gel que contiene al anticuerpo, sólo el antígeno se difunde en una dirección hacia
donde está al anticuerpo para formar una banda de precipitación.

Inmunodifusión doble bidimensional (método de Oakley Fulthorpe): Si se coloca una porción de agar
suave entra la capa de gel con el antígeno o anticuerpo incorporado, ambos, tanto antígeno como
anticuerpo, se moverán unos hacia el otro y se formará la banda de precipitación cuando se
encuentren en el agar suave (-8-1%, entre más diluido esté el agar más suave y blando va a estar).

Los dos anteriores eran lineales

Inmunodifusión radial (método de Mancini)

El gel con el anticuerpo incorporado se coloca en una placa/laminilla y se realizan varias

perforaciones en el gel. Cuando la gota del antígeno se coloque en el pocillo, se difundirá
radialmente en todas las direcciones y se encontrará con el anticuerpo, por lo que al interaccionar
con él se formará una banda o halo de precipitado alrededor del pocillo.

Inmunodifusión doble (método de Ouchterlony) fue la que se hizo en laboratorio

En una laminilla que contiene un gel de agar, el anticuerpo se coloca en un pocillo central y alrededor
de él se colocan pocillos que contienen diferentes antígenos. Ambos, antígeno y anticuerpo, se
mueven uno hacia el otro en todas las direcciones y forman bandas.

El precipitado se forma de tres formas:

• Se difunden uno con otro, lo que indica que ambos antígenos son idénticos (precipitado en forma
de V)

• Se cruzan uno con otro, lo que indica que no están relacionados

• Se puede cruzar de forma asimétrica, indicando reacción cruzada o identidad parcial, mezcla de
epítopos.

Ejemplos de la aplicación de la doble inmunodifusión

Prueba de Elek para la identificación de Corynebacterium diphtheriae, en esta prueba se usa como
reactivo un anticuerpo que reconoce a la toxina diftérica (interrumpe la traducción de proteínas)
hay colonias que la producen y no, para saberlo se usa ese reactivo para embeber un papel filtro
que quepa en una caja de cultivo , también una colonia que produzca la toxina y otra que no (de
referencia), en la placa se hace un cultivo de la referencia toxigénica y del otro lado la referencia
que no es toxígena y en medio la que se aisló junto con el papel, se incuba. En la que si la producía
da una línea de precipitación, si hay precipitación y es un V es señal de que tienen la misma identidad

Práctica No. 4 Aloantígenos y aloanticuerpos. pruebas

cruzadas
Diferencias Genéticas

Tu genoma es sólo alrededor de 0.1% diferente de el de cualquier otra persona, pero equivale a …
3 millones de diferencias en tu DNA

Todas estas posibles variaciones genéticas pueden corresponder a regiones que no codifican para
una proteína, como también para regiones codificantes y con significado funcional (e. j.en tandem
cortas el número de repeticiones, estas no codifican para ningún gen, el SNP de una base
nitrogenada, si cambia el funcionamiento (Gen de la Metilentetrahidrofolato reductasa))
Variaciones alélicas, un gen que tiene una función puede tener varias formas (color de ojos)

¿Que pasará con las variaciones alélicas HLA?

• HLA-I como ejemplo en variación genética

• El cromosoma 6 donde se encuentran los loci que codifican para los MHC (en el brazo corto),
los locus para las cadenas alfa y beta
• En nuestras células están las dos que muestra el cromosoma

En otra persona se pueden dar la ocupación de otros alelos diferentes

Solos los exones 1 y 2 son variables, los demás son parecidos o constantes
En caso de un trasplante

Los antígenos funcionarán como aloantígenos y promoverán la aloinmunización y generación de

aloanticuerpos, esto da el posible rechazo agudo o crónico

El rechazo de injerto se clasifica en base a características histopatológicas y la evolución temporal

del rechazo:

Tipos de Rechazo

• Agudo a los días

• Crónico a las semanas, meses o años
• Hiperagudo primeras horas (por ya haber preexistencia)

No hay aloanticuerpos preexistentes, anti-HLA

ACTIVACIÓN DIRECTA (rechazo agudo)

Lesión del parénquima del injerto y de los vasos sanguíneos mediado por los linfocitos T y los
anticuerpos alorreactivos.

Se genera de días a unas pocas semanas, tiempo para generar linfocitos T efectores alorreactivos y
Ab vs el injerto

Los patrones de rechazo de dividen en celular (mediado por linfocitos T) y humoral (mediado por
anticuerpos), ambos pueden coexistir (rechazo agudo)
ACTIVACIÓN INDIRECTA (rechazo crónico)

Oclusión arterial como resultado de la proliferación de las células musculares lisas de la íntima, lo
que genera una lesión isquémica.

Vasculopatía del injerto o arterioesclerosis acelerada del injerto.

Activación de linfocitos T alorreactivos y secreción de citocinas que estimulan la proliferación de

células vasculares endoteliales y células musculares lisas vasculares

El flujo sanguíneo del parénquima del injerto se ve reducido y el parénquima es sustituido por tejido
fibroso no funcional. (rechazo crónico)

Rechazo Hiperagudo

Los anticuerpos preexitentes de huésped (p. ej. Anti-ABO porque hay alimentos y bacterias con ag
que se parecen) se unen a Ag endoteliales del tejido donante. La unión Ag-Ab activa el
complemento, lo que lleva a una lesión endotelial celular y a la exposición de proteínas de la
membrana basal subendotelial que activa plaquetas. (provoca trombosis)

El sistema ABO y sus anticuerpos representan ejemplos de aloantígenos y aloanticuerpos

El grupo sanguíneo está determinado por residuos de carbohidratos Los grupos ABO están
tipificados por los antígenos ABH

Los antígenos A, B y H son sintetizados por una serie de reacciones enzimáticas catalizadas por
glucosiltransferasas. El paso inicial de la biosíntesis de antígenos A y B es catalizado por A y B
transferasas, codificadas por alelos A y B en el locus genético ABO.

Sustancia precursora Fucosil- transferasa → Grupo O

1. Si es con N-acetilgalactosaminil-transferasa da grupo A

2. Con Galactosil-transferasa es grupo B

3. Con Galactoril-transferasa y N-acetilgalactosaminil-transferasa es AB

4. Sin nada es grupo O

¿Qué es un aloantígeno y un aloanticuerpo?
Aloantígeno son antígenos cuyos genes se encuentran en un mismo locus entre dos individuos, pero
con diferencias suficientes (genotípicas y fenotípicas) para que puedan ser reconocidas como
extraños en otro individuo de la misma especie.

Aloanticuerpo son anticuerpos que pueden reconocer (alo-) antígenos que provienen de otro
individuo de la misma especie, pero con diferencias genéticas suficientes para generarlos.

Práctica 5: EVALUACIÓN DE ISOINMUNIZACIÓN: PRUEBAS

DE COOMBS
Una de las aplicaciones de las pruebas de coombs es evaluar si existe
isoinmunización o aloinmunización. En individuos que poseen diferencia en su Rh.
Dicha aplicación es la más empleada cuando se usa el suero de coombs para la
evaluación del Rh.
El sistema Rh tiene una gran importancia en las transfusiones de sangre, sin
embargo, el ABO es aún más importante. Dicha importancia del Rh es que es de
los antígenos más inmunogénicos que se localizan en la superficie de los glóbulos
rojos. Además, en la obstetricia el Rh es el más importante a considerar, más que
el ABO ya que el Rh es el que genera una respuesta o reacción inmunológicas de
la madre contra el bebé o en transfusiones sanguíneas.
La glucosil transferasa es la responsable de la presencia del sistema ABO, la cual
se origina de genes que codifican para ésta, la presencia de ABO se da por la
transferencia de carbohidratos, lípidos y proteínas de la superficie que están en
todas las células.
Pero para el Rh no es lo mismo que en ABO, ya que este proviene de un gen clásico
de anclaje a membrana (es decir, el antígeno Rh (D)).
La región en el locus del gen que codifica para Rh está ocupada por los genes RHD
y RHCE los cuales esta juntos el uno del otro en el cromosoma 1 (1p34.3 y 1p36.1).
De estos el más importante es el RHD, ya que es altamente inmunogénico. De
ahí es la razón por la cual se realiza la prueba de antígeno Rh D. Dicho gen no se
tiene muy claro su función, solo se estima que funciona como un transporte de
amonios en los eritrocitos, por medio de su membrana ya que los eritrocitos que no
poseen dicho Rh padecen fragilidad osmótica, es decir, la personas que son Rh-
poseen eritrocitos con membrana más delgada y débil que los Rh+, por ello dichos
eritrocitos viven menos.
El gen que codifica para el antígeno D solo se expresa en células de línea eritroide.
Este antígeno es una proteína anclada en la membrana de los eritrocitos con 12
dominios transmembranales.
Es decir, una proteína muy grande que codifica para 12 dominio transmembranales,
en esta proteína o antígeno se forman loops afuera y adentro de los eritrocitos,
siendo los que están afuera los que son altamente inmunogénicos, en particular
las asas 3,4 y 6.

Los anticuerpos contra este antígeno van en particular contra estas 3 regiones.
Esta proteína se codifica en el cromosoma 1, al ser seres diploides (es decir, tener
2 cromosomas 1), los genes están arreglados o acomodados de diferente manera
entre dichos cromosomas.
Cada línea representa un cromosoma en el loocus del cromosoma 1 donde esta el
gen RHD que codifica a dicho antígeno Rh. En la imagen se observa la diferencia
ente personas heterocigotas y homocigotas. Por ejemplo, en el B, cuando el gen Rh
está en los 2 loocus el cromosoma 1, la persona se considera homocigota, es decir,
tiene doble carga genética para expresar dicho antígeno en los eritrocitos por lo que
se dice que es RH+ (o antígeno D). Por otra parte, en el A, una persona
heterocigota, es decir, que solo en un loocu expresa el antígeno Rh con ese será
suficiente para expresar dicho antígeno y ser considerado RH+. En el C, como no
expresa el antígeno Rh en ningún loocus esta será RH- ya que no poseen el gen
para codificarlo.
• Personas Rh+ contienen dos o un alelo que contiene los 10 exones
necesarios para codificar la proteína transmembranal
• Personas Rh - contienen tienen una deleción que abarca los 10 exones en el
locus correspondiente en ambos cromosomas
La región que codifica para RH contiene 10 exones se juntan para un ARNm maduro
y solo codificara RH. Mientras que los que son RH- presentan deleción es decir se
perdió el gen RHD ya que se une a la caja Rhesus 3’ y forma un promotor hibrido.
La isoinmunización es lo mismo que la aloisoinmunización, esto es la generación de
anticuerpos dirigidos contra antígenos de individuos de la misma especie que no se
encuentran en el individuo inmunizado.
Este concepto se usa para términos de Rh y obstetricia, así como describir el estado
del Rh y su aloinmunización frente a una mujer embarazada. Ya que si una mujer
embarazada tiene ausencia del antígeno RH (es decir, RH-), hay posibilidad de que
el bebe si tenga el antígeno RH heredado de su papá hay riesgo de que la mamá
genere anticuerpos contra los antígenos Rh de los eritrocitos del bebe y esto hará
que los destruya.
Las IgG atraviesan la membrana placentaria porque pasa a través del torrente
sanguíneo donde le administra nutrientes al bebe, sin embargo, esta comunicación
del torrente sanguíneo no es directa ya que hay una barrera entre ellas la cual es la
placenta, es decir, él bebe está conectado a la placenta por el cordón umbilical el
cual introduce los nutrientes al bebe, la placenta tiene lugares llamados espacios
intervellosos los cuales están conectados los vaso sanguíneos de la madre. Este
los vasos sanguíneos de madre e hijo hay una capa de tejido llamado
sincitiotrofoblasto el cual son células que no tiene membrana biológica entre ellas
y es el encargado de hacer un tipo filtro entre la sangre de madre e hijo, este
transportar las IgGs de la madre al bebé.
Esto sucede de forma en que en el espacio intervelloso hay una pequeña capa de
células fusionadas entre ellas las cuales forman el sincitiotrofoblasto en el cual hay
proteínas llamadas FC neonatal (FcRn) las cuales son receptores que reconoce
los sitios Fc de IgG, es decir, un receptor FC gamma neonatal (porque para IgG
cadena pesada es gamma). Estas toman a IgG y forma un endosoma (endocitan
IgG con dicha proteína) de esta forma pueden ser expulsados hacia el torrente
sanguíneo de la madre, pero aquellos que entran al torrente sanguíneo del bebe
hacen que se formen IgGs anti-Rh. El pH en el sincitiotrofoblasto es de 6.5

Es decir, dicha capa evita que los eritrocitos del bebe puedan salir a la sangre de la
madre. Si llegan a salir a la sangre de la madre esta formará anticuerpos contra
el bebé provocándole una enfermedad hemolítica (EHRN). Ya que con los
anticuerpos de la madre destruirá los eritrocitos del bebe provocando una hemolisis,
esto le provoca al bebe una eritroblastosis fetal ya que al haber una gran
destrucción de eritrocitos habrá una gran cantidad de hemoglobina libre en su
sangre y esta se transformará en bilirrubina, provocando ictericia. La bilirrubina es
muy tóxica para el bebé ya que provoca bajo tono muscular y sobre todo afectando
su sistema nervioso central provocando un daño en su cerebro llamado
Kernicterus. Dañándose también el nervio auditivo (sordera). Como tratamiento el
bebe se somete a luz ultravioleta ya que esta destruye la bilirrubina.
Para evitar todo esto se requiere que la madre sea sometida a una vacuna
profiláctica de dos dosis de casi comienzo y final del embarazo.
En esto sucede ya que con dicha vacuna se inocula con globulinas inmune a RHD
o antígeno D los cuales destruyen los glóbulos rojos del bebe en la sangre de la
mamá evitando que ésta sea estimulada y comience a producir anticuerpos.

No solo los Anti-Rh son los únicos que pueden causar incompatibilidad sanguínea
entre madre e hijo. Siendo los más importantes ABO y Rh.
Además, existe un grupo de otras glicoproteínas menos frecuentes, que también
pueden estar presentes en la membrana de los eritrocitos como el sistema Kell,
Duffy, MNSS, Lewis y Kidd, todos capaces de generar una respuesta inmune. En
general, los anticuerpos anti.
Los anticuerpos se pueden clasificar en regular e irregulares siendo los regulares
generados por una estimulación antigénica natural (enfrentarnos a un antígeno), y
los irregulares se generan contra antígenos de individuos de la misma especie sin
ser anti-A y anti-B ya que estos se obtienen por reacción cruzada con polisacáridos
de la microbiota intestinal. Los irregulares son por isoinmunización.
Con la prueba de coombs se evalúa la presencia de anticuerpos irregulares sobre
la superficie de eritrocitos. Este no solo se usa para diagnostica el Rh sino además
para reconocer inmunoglobulinas humanas siendo policlonal reconociendo muchas
regiones de las globulinas humanas, y además posee factores del sistema del
complemento.
Por ejemplo, si hay eritrocitos con anticuerpos anti-RH o IgG se usa el suero de
coombs con anti-globulina humana que reconoce regiones de las inmunoglobulinas
que están unidas a los eritrocitos esto hará que se comiencen a unir entre ellos
formando una aglutinación. Hay de forma directa e indirecta siendo la de la
inmunización materno fetal para ambas.
La forma directa del suero de coombs al ver sospecha con el bebe se toma sangre
del bebe, se toma una muestra de sangre del bebe y se le agrega el suero de
coombs y si hay aglutinación entonces se confirma que si hay sensibilización de
eritrocitos por anticuerpos anti-RH.

La forma indirecta es para ver si la madre ha desarrollado anticuerpos anti-RH, por

lo que se toma suero de la madre y se le agrega sangre RH+, después se agrega
el suero de coombs y si hay aglutinación se confirma que si hay presencia de dichos
anticuerpos.
Práctica 6: Caracterización de la estructura de anticuerpos
por Western Blot
• El antígeno reacciona con el anticuerpo y su isotipo es desconocido.
• Este ayuda a la identificación de cualquier antígeno.
• Por medio de inmunoblot o Inmunolocalización.
• Es una técnica de biología molecular.
• La Inmuno blot o western blot es una técnica utilizada para identificar una
proteína de una muestra que contiene una mezcla de varias proteínas.
• Se da una interacción de antígeno con anticuerpo, siendo dicho antígeno de
naturaleza proteica en su mayoría.
• Este se realiza extrayendo proteínas las cuales se separan de una mezcla
de proteínas por electroforesis en función de su tamaño molecular.
• Se usa un papel pegado (nitrocelulosa) a electroforesis con gel de
poliacrilamida, en este se colocan las proteínas.
• La detección específica de una proteína de interés por anticuerpos
específicos.
Casos a utilizar WB
• Identificación de proteína presente en muestra
• Tratamiento con un determinado Fármaco/agente puede aumentar o reducir
el nivel de exposición de mi proteínas.
• Como varia el nivel de expresión de las proteínas en distintos tejidos o líneas
celulares
• Mi muestra es sana o patológica → El Western blog permite detectar agentes
como Mt, el HCV, el HIV, etc
Organización:

1. Preparación de la muestra para la electroforesis – Extraer muestra

2. Electroforesis en gel (separación de proteínas)
3. Transferencia a gel – membrana (papel de nitrocelulosa)
4. Inmunodetección (incubación con Ag especifico reaccion Ag - Ab)

PASO 1: PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA ELECTROFORESIS

a. Lisis: (buffer de lisis) Las células o los tejidos se tratan con un buffer de lisis
y destruyen o lisan mecánicamente para liberar las proteínas. Disgregar
membrana para liberar proteínas
b. Cuantificación de proteínas (Método de Bradford)
• Para la cuantificación de proteínas el método de Bradford es el más
empleado.
• Proteína (gran cantidad de aa básicos) + colorante (cumaci – café)
• Complejo con a aromáticos genera color azul
• A medida que azul aumenta indica mayor contracción de proteínas
• espectrofotometría, 595 nm se mide por absorción
• Usar curva estándar

c. Condiciones reductoras y desnaturalizantes

• Las muestras son normalmente tratadas con agente que rompen las
estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras
terciarias)
 • Añadir buffer carga

− SDS: detergente iónico

✓ Carga negativa hidrocarbonada: rompe fuerzas iónicas en
hidrofóbicas entre residuos de aa
✓ Proteína se abre, abre madeja
− DTT/beta – mercaptoetanol
✓ Agente reducto
✓ Rompe puentes disulfuro generan reducción de enlaces
✓ S-S gana H (electron +) de S-S → S – H
✓ Se termina de abrir

d. Recomendaciones

− Principal falla es culpa de extracción de la muestra

− Mantener las muestras en hielo o a 4C para evitar degradación de las
proteínas: proteasas al haber a lisis teniendo un buen pH y T° adecuada
empiezan a comer proteínas libres, por ello a 4°C pues al no estar a esta
temperatura trabajan más → DEGRADAN LA MUESTRA
− Los buffers deben prepararse en el momento y mantenerse en frío (sales y
detergentes juntos puede precipitar dejando sin función a buffer)
− Antes de realizar la lisis, añadir al buffer un cocktail de inhibidores de
proteasas
− Si la proteína de interés está fosforilada, es importante asegurarse de incluir
inhibidores de fosfatasas al buffer de lisis.

PASO 2: ELECTROFORESIS EN GEL

Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su
movilidad electroforética.
SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
1. El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el buffer
de migración (campo eléctrico). Un buffer de migración contiene 25 mM Tris,
190 mM glicina, 0.1% SDS, pH 8.3
 2. Los lisados proteicos se cargan en el gel, normalmente 20-10 g por carril.
3. Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas
hacia el polo positivo (hacia ánodo).
4. Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas
endógenas de las mismas son despreciables.
5. El resultado es que las proteínas se separan en función de su tamaño o peso
molecular.
6. Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del gel
y por tanto migran más rápidamente.

PASO 3: TRANSFERENCIA GEL – MEMBRANA

− Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la proteína de interés

para poder visualizarla
− El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las proteínas (se
necesita una superficie semisólida → reacción Ag-Ab más fácil):
▪ Los anticuerpos no son retenidos en el gel
▪ Los geles son frágiles y difíciles de manipular
− Por lo tanto, es necesario transferir las proteínas a un soporte más adecuado
− El principio es similar al de SDS-PAGE, es decir, las proteínas cargadas
negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo
eléctrico
− Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo
− Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición
que el gel
− Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinildeno
(PVDF), éstas últimas requieren pretratamiento con metanol
− Un buffer de transferencia se compone normalmente de 25 mM Tris, 190 mM
Glicina y 20% de Metanol
Paso 4: Inmunodetección

Los colorante como el Coomassie pueden usarse para teñir las proteínas después
de realizar el SDS-PAGE

1° → Primero bloqueo. Cualquier proteína se le puede pegar a la nitrocelulosa

por ello hay que evitar que Ab se pegue, para ello antes de agregar Ab se bloque
nitrocelulosa con leche BSA así evita la unión de Ab en espacios inespecíficos
El uso de anticuerpos específicos soluciona el problema detectando únicamente la
proteína de interés
▪ Anticuerpo primario
− se une a proteína de interés (este no se ve)
 − Interactúa como epítopo

▪ Anticuerpo secundario
− Reconoce a anticuerpo primario como antígeno → proción FcIgG
− La porción Fc del Ab tiene una enzima (peroxidasa). La diaminobencidina
o DAB es un producto químico generalmente conjugado a un anticuerpo.
La diaminobencidina reacciona con el agua oxigenada (H2O2),
generando un sustrato que reacciona con la enzima peroxidasa, dando
como resultado un producto que precipita en región de Ag – Ab y forma
una señal visible. Otra es que la Ab secundario porte una molécula
fluorescente que genere luz evidente al someterla a radiación UV.

Diagrama de flujo de esta técnica.

Controles recomendados

− Nos permite asegurar que la técnica fue realizada correctamente al no ver

nada en la inmunodetección
− A través de la inmunodetección de proteínas que siempre van a estar:
▪ Beta – Actina
▪ GAPDH
 ▪ proteínas de unión
▪ TATA
▪ Entre otras
Selección de anticuerpos
▪ Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testeados en Western Blot.
▪ Las aplicación en las que un anticuerpo ha sido testeado se indican en la
ficha técnica del anticuerpo.
▪ Saber de Ag primario isotipo y animal y secundario debe concordar con este,
por ejemplo si para primario se escoge IgG de conejo en el secundario se
debe elegir Anti – conejo IgG