TP Nº 1: Introducción a las Técnicas Inmunológicas

Introducción a las Técnicas Inmunológicas

TP Nº 1: Introducción a las Técnicas Inmunológicas

Definición:
 Las técnicas inmunoquímicas y los inmunoanálisis (denominadas
inmunoensayos) se basan en las interacciones antígeno-anticuerpo
(Ag-Ac) que llevan a la formación de inmunocomplejos, los cuales
serán detectados mediante diversos métodos experimentales.

• Los antígenos (Ag) son sustancias capaces de estimular el sistema inmunitario

y generar una respuesta específica frente a ellos.
• Los determinantes antigénicos, denominados epitopes, son las regiones
moleculares de Ag que son reconocidas y a las cuales se une el anticuerpo.
• Un Ag puede tener uno, o varios epitopes iguales o diferentes.
• Los anticuerpos (Ac) pertenecen a un grupo de glicoproteínas denominadas
inmunoglobulinas (Ig), y se clasifican en IgA, IgD, IgE, IgG y IgM.
• Los Ac son producidos por los linfocitos B y las células plasmáticas.
• Presentan en su estructura molecular una región que es la encargada de
reconocer y unirse específicamente a un epitope específico del Ag.
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Interacción Ag-Ac:
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Interacciones Ag-Ac primarias y secundarias:

• En la interacción de un Ag con su correspondiente Ac se
distinguen 2 etapas:
1. la interacción primaria (in vitro e in vivo) establecida por las
interacciones no covalente, no visualizables.
2. la interacción secundaria (in vitro) que sigue a la anterior y se
caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la
aglutinación o la precipitación.
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Inmunoensayos:

1°

2°
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Características de la interacción 1º Ag-Ac:

➢ La unión Ag-Ac es una interacción reversible en la que sólo
intervienen enlaces no-covalentes entre el epitopo del Ag y el Ac.
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Afinidad y Avidez de la interacción 1º Ag-Ac :

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Características de la interacción 2º Ag-Ac:

➢ Las técnicas inmunológicas que evidencian la interacción Ag-Ac a través
de una reacción secundaria (precipitación o aglutinación) son,
generalmente, más económicas y sencillas que aquellas que permiten
visualizar la interacción primaria.

➢ Al mezclar cantidades suficientes de Ag solubles o particulados con Ac

específicos, la interacción Ag-Ac puede da lugar a una red capaz de ser
visualizada como un precipitado o como grumos. Esa red no es otra cosa
que grandes complejos inmunes (CI) formados por Ag-Ac.

➢ No siempre que se produce la interacción 1º Ag-Ac, se produce también

la interacción 2º, ya que, para lograr fenómenos visibles, se requieren
determinadas concentraciones y características de los Ag y Ac.
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Características de la interacción 2º Ag-Ac:

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Características de la interacción 2º Ag-Ac:

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Características de la interacción 2º Ag-Ac:

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Interacción 2º Ag-Ac – Reacciones de precipitación:

o Se basan en la aparición de un precipitado visible cuando se enfrentan
antígenos solubles con sus anticuerpos específicos.

➢ Precipitación en medio líquido:

De uso infrecuente en la actualidad, detecta la
presencia de Ag ó Ac cuando se mezclan en fase
líquida.

➢ Precipitación en medio sólido:

Utiliza un soporte sólido gelificado en el que
difunden el Ag y el Ac. Se clasifican en técnicas de:
inmunodifusión o inmunoelectroforésis.
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Técnicas de precipitación en medio sólido:

✓ Los soportes sólidos más utilizados son los geles de agarosa:
▪ Estructura macroreticular con una malla muy abierta
▪ Ausencia de grupos iónicos, es una estructura neutra e inerte.
▪ No hay interacción de las moléculas a difundir con la estructura del gel.

✓ Se basan en el hecho de los Ag o Ac pueden difundir libremente a través de los

poros del gel de agarosa.

✓ Al contactarse Ag y Ac específicos, forman banda de precipitado en la zona de

equivalencia.

✓ Aplicaciones prácticas:
➢ determinar la concentración de Ag o Ac (cuantitativos)
➢ comparar Ag y evaluar su pureza (cualitativos)
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Técnicas de precipitación en medio sólido:

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Técnicas de precipitación en medio sólido:

➢ Ventajas: ➢ Desventajas:

• Existen varias pruebas • Baja sensibilidad

• Se observan fácilmente • Requieren de elevadas
• No requieren equipos costosos conct.de Ag y Ac
• Pueden ser cuali o cuantitativas
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Técnicas de precipitación en medio sólido:

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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación:

➢ Inmuno Difusión Radial (IDR) :
o Permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas
de isotipo G, M y A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc)
presentes en muestras biológicas.
✓ Se basa en la difusión de la muestra conteniendo el Ag a
medir (inmunoglobulinas o antígenos solubles) en una matriz
semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac
específico.
✓ La muestra biológica se introduce en los orificios excavados
en el agar y a medida que el antígeno difunde en forma radial,
se alcanza la relación Ag-Ac que permite la formación
precipitados visibles.
✓ Una vez finalizada la difusión se mide el radio (R) de los
precipitados que es proporcional a la concentración de
antígeno (C).
✓La concentración de proteína en la muestra biológica (Cx) se
calcula realizando una curva de calibración utilizando
muestras patrones de concentración conocida.
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación:

➢ Inmuno Difusión Radial (IDR):
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación:

➢ Inmuno Difusión Doble (IDD) o Técnica de Ouchterlony:
o Permite evaluar la pureza o composición de los Ag presentes en una
muestra biológica.
✓Ambos inmunoreactantes difunden radialmente uno hacia el otro.
✓ Cuando están en la zona de equivalencia se observa la banda de precipitado
✓ Difusión depende de:
▪ concentración del gel
▪ concentración de reactantes
▪ tamaño de las moléculas Ag y Ac
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación:

➢ Inmuno Difusión Doble (IDD) o Técnica de Ouchterlony:

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➢ Inmuno Difusión Doble (IDD) o Técnica de Ouchterlony:
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación:

➢ Inmunoelectroforesis:

o Método combinado:
1) Electroforesis para separar una mezcla de Ag de acuerdo a su carga
2) Difusión radial de las proteínas separadas, que reaccionan con Ac
específicos y precipitan.

Aplicaciones:
• Diferenciar fracciones antigénicas específicas.
• Determinar Ac monoclonales clásicos en mieloma y linfomas.
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación:

➢ Inmunoelectroforesis:
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de aglutinación:

➢ Aglutinación directa:
o Se basan en la aparición de una aglutinación visible a simple vista
cuando se enfrentan Ag particulados con sus Ac específicos

✓Los Ag deben conservar su forma nativa.

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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de aglutinación:

➢ Ejemplos de aglutinación directa:
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- Técnica semicuantitativa

- Título: la inversa de la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible

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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de aglutinación:

➢ Aglutinación indirecta:
o Se basa en que los Ag solubles pueden fijarse sobre partículas más
grandes, como por ej. glóbulos rojos, partículas de látex, gelatina, etc.
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de aglutinación:

➢ Aglutinación indirecta:
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Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de aglutinación:

➢ Ejemplos de aglutinación indirecta:
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Técnicas inmunológicas basadas en las interacciones 1º Ag-Ac:

✓ Si bien la interacción primaria Ag-Ac no es visible, existen distintos métodos
que hacen posible visualizarla.

o La estrategia consiste en "marcar" al Ac o al Ag mediante la unión

covalente (conjugación) de determinadas moléculas, tales como
FLUOROCROMOS, ISOTOPOS RADIOACTIVOS o ENZIMAS, para poder
hacer visible esta 1º interacción.

✓ Las técnicas que veremos a continuación no son tan sencillas y económicas

como las que vimos anteriormente.

✓ Sin embargo son mucho mas sensibles, es decir, son capaces de detectar
menores concentraciones de Ag o Ac.
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Técnicas inmunológicas basadas en las interacciones 1º Ag-Ac:

✓ Tal como se observa en la Tabla, dependiendo del marcador que se utilice, la
técnica inmunológica recibe un determinado nombre y utiliza un sistema de
detección diferente:

d- Western Blot (WB) Enzima Quimioluminiscencia

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Técnicas inmunológicas basadas en las interacciones 1º Ag-Ac:

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➢ Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunocitoquímica (ICQ):

o Técnicas de inmunodetección indirecta basadas en el uso de sustratos
cromógenos que generan un precipitado de color en el sitio de reacción, visible
al microscopio óptico. Se aplica al análisis de la expresión y localización
de Ag en cortes histológicos (IHQ) o cultivos celulares (ICQ).

✓ Técnica relativamente sencilla

✓ Prolongada preservación de la
muestra

✓ Análisis histo- o cito- morfológico

bien definido

✓ De gran utilidad diagnóstica

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➢ Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunocitoquímica (ICQ):

Protocolo experimental IHQ:
✓ Obtención de la muestra
✓ Preservación en formol
✓ Deshidratación e inclusión
✓ Recuperación antigénica
✓ Inactivación de la Peroxidasa (Px)
endógena
✓ Bloqueo de sitios inespecíficos
✓ Aplicación de Ac 1º y 2º (conj a Px)
✓ Incubación con el cromógeno
✓ Contra-tinción nuclear
✓ Análisis al microscopio
Protocolo experimental ICQ:
✓ Cultivo celular
✓ Fijación y recuperación antigénica
✓ Inactivación de la Peroxidasa
endógena
✓ Bloqueo de sitios inespecíficos
✓ Aplicación de Ac 1º y 2º (conj a Px)
✓ Incubación con el cromógeno
✓ Contra-tinción nuclear
✓ Análisis al microscopio
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➢ Ejemplos de IHQ e ICQ:

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➢ Inmunofluorescencia (IF):
o Técnica de inmunodetección directa o indirecta basada en el uso de
fluorocromos que emiten una señal de un determinado color que se detecta
en microscopios de fluorescencia.
o Se aplica al análisis de la expresión y localización
de Ag en cortes histológicos o cultivos celulares.

✓ Técnica relativamente sencilla

✓ Marcación simultánea de 2 o más Ag
✓ Permite evaluar co-localización de Ag

❖ Análisis histo- o cito- morfológico

poco definido
❖ Menor tiempo de preservación de la
muestra
❖ Requiere de equipamiento costoso
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➢ Inmunofluorescencia (IF):
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Técnicas inmunológicas basadas en las interacciones 1º Ag-Ac:

➢ Ejemplos de Inmunofluorescencia (IF):
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➢ Citometría de flujo:
o Técnica de inmunodetección directa (a veces indirecta) basada en el uso de
fluorocromos que emiten una señal de una determinada longitud de onda que
se detecta en un citómetro.
o Se aplica al análisis de la expresión de Ag en células aisladas de tejidos o de
cultivos celulares, que permiten su identificación y caracterización fenotípica.

✓ Técnica relativamente sencilla

✓ Marcación simultánea de 2 o más Ag

❖ No permite el análisis
histo- o cito- morfológico
❖ Equipamiento costoso
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➢ Marcado de la muestra para citometría de flujo:

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➢ Análisis de los resultados de la citometría de flujo:

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➢ Análisis de los resultados de la citometría de flujo:

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➢ Radioinmunoanálisis (RIA):
o Técnica de inmunodetección que se basa en la inhibición competitiva de la
unión de un Ag marcado radiactivamente con su Ac específico, por parte de Ag
idénticos no marcados presentes en la muestra a analizar.
o Permite cuantificar la presencia de pequeñas cantidades de un determinado
Ag o Ac en una muestra biológica.

✓ Elevada sensibilidad
✓ Cuantitativa!!

❖ Uso de radioisótipos
❖ Equipamiento costoso
❖ No permite caracterizar la
composición de la muestra
(Se debe conocer el Ag
a determinar)
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➢ Técnicas radioinmunométricas: PRIST y RAST:

o Técnicas que permiten la detección de un Ag presente en una muestra
mediante el uso de anticuerpos conjugados a un isotopo radioactivo.
o No deben considerarse sinónimo de RIA ya que no se basan en la inhibición
competitiva por desplazamiento del Ag caliente.
➢ La técnica de PRIST (Paper disk Radio Immuno-Sorbent Test) es utilizada para
medir los niveles de IgE en sueros.
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➢ Técnicas radioinmunométricas: PRIST y RAST:

➢ La técnica de RAST (disk Radio Allergo-Sorbent Test) se utiliza para dosar los
niveles de IgE específica para un alergeno en particular. El alergeno viene
adsorbido a un disco de papel y luego se incuba el suero del paciente alérgico.
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➢ Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay (ELISA):

o Técnica de inmunodetección que utiliza Ac marcados con una enzima para
poder visualizar la reacción Ag-Ac.

o La técnica se utiliza tanto para cuantificar la presencia de Ag como de Ac en

una muestra biológica.

✓ Elevada sensibilidad
✓ Cuantitativa!!

❖ Se debe conocer
el Ag a determinar
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➢ELISA de captura ó “sandwich”:

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➢ Western Blot (WB):

o Técnica de inmunodetección que se basa en la separación electroforética de
proteínas en geles de poliacrilamida, la transferencia (blotting) de dichas
proteínas a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa) y la posterior
detección de una o más bandas identificadas por Ac específicos.
o La migración de las proteínas se realiza en presencia de detergentes (Dodecil
Sulfato de Sodio, SDS) a fin de que su migración dependa fundamentalmente
de peso molecular (PM) de las proteínas.
o Permite identificar 1 o más Ag o Ac en una muestra compleja.

✓ Elevada sensibilidad
✓ Semi-cuantitativa
✓ Económica
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➢ Western Blot (WB):

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➢ Western Blot (WB):