INSTRUMENTACIÓN QUÍMICA ANALÍTICA II

DETECTORES EN CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

No hay detectores para cromatografía de líquidos tan universalmente aplicables como los detectores
de ionización por llama y conductividad térmica para cromatografía de gases.
Los detectores de cromatografía de gases fueron específicamente perfeccionados para medir
pequeñas concentraciones de analitos en flujos de gas. Por otro lado, los detectores de
cromatografía de líquidos han sido instrumentos analíticos tradicionales adaptados con celdas de
flujo para medir concentraciones bajas en flujos de líquidos. El problema principal en el
mejoramiento de la cromatografía de líquidos es la adaptación y perfeccionamiento de dichos
dispositivos.
El detector ideal para la cromatografía de líquidos debería poseer todas las características que se
mencionan respecto a los detectores de cromatografía de gases;
1. Sensibilidad adecuada. Justo lo que constituye una adecuada sensibilidad no puede
evaluarse de forma cuantitativa. En general las sensibilidades de los detectores actuales se
encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2. Buena estabilidad y reproductividad.
3. Respuesta lineal para los solitos que se entienda a varios ordenes de magnitud.
4. Intervalo de temperaturas desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C.
5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo.
6. Alta confiabilidad y manejo sencillo. El detector debería estar a prueba de la impericia de
operadores inexpertos, si es posible.
7. Respuesta semejante para todos los solitos o por el contrario una respuesta selectiva y
altamente predecible para uno o más tipos de solutos.
8. No debe destruir la muestra.

Solo que existen unas excepciones; un detector de cromatografía de líquido no requiere ser sensible
en intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen
interno mínimo con el fin de reducir el ensanchamiento de banda y ser compatible con el flujo de
líquidos.

Los detectores para cromatografía de líquidos son de dos tipos. Los detectores basados en una
propiedad de la solución son sensibles a una propiedad de la fase móvil, como el índice de
refracción, la constante dieléctrica o la densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En
cambio, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades
de este último, como la absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no son
inherentes a la fase móvil.

Ultravioleta-visible
Los primeros detectores de absorción fueron los fotómetros de filtro con una lampara de mercurio
como fuente. Lo más común era aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos
equipos también se podían utilizar las líneas a 250, 323, 334 y 365.
Los instrumentos más versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o wolframio, y un
monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda óptima, de ultravioleta o visible, para
detectar los analitos estudiados.
Este se efectúa de la siguiente manera; El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de
una pequeña celda, de pequeño volumen (entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de
banda. La medida de la absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el

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cromatograma. Su límite de detección oscila entre 0.1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía

de elución en gradiente.

Figura 1. Esquema del equipo detector de Uv-vis para HPLC.

Varios grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas, exhiben bandas de absorción
anchas a una o más de esas longitudes de onda del ultravioleta.

Algunos aniones inorgánicos presentan bandas de absorción ultravioleta que son resultado de
electrones no enlazantes que se excitan. Entre los ejemplos están iones nitrato (313 nm), carbonato
(217 nm), nitrito (360 nm y 280 nm), azina (230 nm) y tritiocarbonato (500 nm).

Arreglo de diodos
Las partes que lo componen son: una lampara, un obturador, sistema de lentes cromáticos, celda de
flujo, lentes, slit, gradilla holográfica y un arreglo de fotodiodos. De esta manera, la lampara es la
fuente de luz que se encarga de proveer de energía radiante en el intervalo de longitudes de onda
requerido para el análisis. Esta energía pasa por un obturador y entra al policromador que ayuda a
que una gran longitud de onda pase por la muestra que se encuentra en la celda de flujo. Una vez
que la luz es fraccionada en los diferentes componentes de la longitud de onda, es enfocada hacia el
arreglo de diodos.
Los elementos foto-sensibles son arreglados como paquetes lineales, similares a los usados en los
circuitos integrados (un elemento por cada longitud de onda analizada).
En esta serie de diodos cada diodo es un capacitor que es cargado por un circuito en el arreglo.
Cuando la luz golpea el diodo este conduce una corriente y descarga el capacitor. La cantidad de
electricidad descargada es proporcional a la cantidad de luz que choca en el diodo y la eficiencia
quantum del diodo. La magnitud de la descarga se mide cuando el circuito intenta recargar el

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capacitor. Cada descarga eléctrica en cada elemento es medio separadamente. El arreglo por
completo es barrido a un intervalo determinado para determinar la carga de cada elemento. La razón
de barrido se obtiene a través del promedio de la energía luminosa que golpea los elementos que
son capaces de transportar carga y no tienen que ser barridos frecuentemente como los elementos
pequeños. Entre mas veces se efectué el barrido habrá mas oportunidades de que el ruido
electrónico limite la capacidad del instrumento para distinguir entre el fondo y una señal verdadera,
por lo tanto, afectando el límite de detección.
Finalmente, la señal llega a un integrador en donde se lleva a cabo el manejo de la misma. Con el
adelanto de los sistemas computacionales, se logro crear programas que permiten de manera mas
amigable y efectiva el análisis de la información generada por el HPLC.

Figura 2. Esquema del funcionamiento de un detector de arreglo de diodos.

Índice de refracción
Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente que en su camino
hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la
otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo
de modo que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación de
un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del
detector provoca una variación de la señal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada,
proporciona el cromatograma.
Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es
decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía de gases.
Además, son fiables y no dependen del caudal pueden analizar algunos analitos como azucares. Sin
embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura
constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la
mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.

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Figura 3. Esquema del funcionamiento de un detector de índice de refracción.

Quirales
Los detectores quirales se utilizan para la detección de compuestos ópticamente activos como
aminoácidos, azúcares, terpenos y otros compuestos que contienen un carbono asimétrico.
hay dos técnicas de detección quiral, polarimetría o dispersión rotatoria óptica (Ord) y dicorismo
circular (cd).
Los detectores Ord se basan en diferencias en el índice de refracción y los detectores cd diferencian
los enantiómeros midiendo las diferencias entre la absorción de luz y la luz polarizada
circularmente a la izquierda debido a la existencia de cromóforos quirales.
Dispersión rotatoria óptica (ORD)
Es la variación en la rotación óptica de una sustancia con un cambio en la longitud de onda de la luz
La dispersión rotatoria óptica se puede utilizar para encontrar la configuración absoluta de
complejos metálicos. Por ejemplo, cuando la luz blanca polarizada en el plano de un retroproyector
pasa a través de un cilindro de solución de sacarosa, se observa un arco iris en espiral perpendicular
al cilindro.

Dicroísmo circular (CD)

El dicroísmo circular es una técnica de espectroscopía de absorción electrónica, basada en el
cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado,
debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada.
La característica más importante de un Espectro polarímetro de Dicroísmo Circular, es que debe
contar con una fuente de luz polarizada. En general un espectrofotómetro de dicroísmo circular
cuenta con un generador de radiación (fuentes de carburo de silicio), que inicialmente se filtra y
luego se polariza. Esta pasa por un modulador fotoelástico que consiste en un material que se
comprime y expande para producir radiación circularmente polarizada (generalmente un cristal de
seleniuro de zinc) la cual incide sobre la muestra bajo estudio, (disuelta generalmente en
tetracloruro de carbono o en deuterocloroformo), colocada en una celda con ventanas de materiales
estables (como BaF2).

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Conductividad
Tipo de detector que se basa en los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de
moléculas de analito. Están formados por una celda asilada que contiene dos electrodos sobre los
que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla
eluida, la cual está relacionada con su concentración.
Este detector es útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de detección se encuentra
entre 0’5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse en elución en
gradiente.

Figura 5. Esquema de una célula de un detector conductividad.

La respuesta de estos detectores es lineal frente a la concentración en un intervalo muy amplio, de

manera que es posible cuantificar la señal de salida por medio de una correcta calibración
preliminar. Los mejores resultados con este detector se obtienen en los análisis isocráticos, ya que
los gradientes dan lugar a una deriva proporcionalidad en la línea base.

Electroquímico

Este tipo de detectores están basados en la oxidación del analito eluido mediante un electrodo
adecuado, registrándose la intensidad de la corriente, mantenida mediante la electrolisis de los
analitos, a lo largo del cromatograma.

Responde a analitos que pueden oxidarse o reducirse, como fenoles, aminas aromáticas, peróxidos,
mercaptanos, cetonas, aldehídos, nitrilos conjugados, compuestos halogenados o nitroaromáticos.
Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbón vitrificado. Para solutos
reducibles, un buen electrodo de trabajo puede ser el de gotas de mercurio.

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La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un intervalo de seis órdenes de

magnitud. Se tiene que trabajar con disoluciones acuosas o de disolventes polares que contengan
electrolitos, y deben estar rigurosamente exentas de oxígeno. Los iones metálicos que puedan
proceder de los tubos se deben enmascarar añadiendo EDTA al disolvente. Estos detectores son
muy sensibles a las variaciones de caudal y de temperatura.

Figura 3. Grupos funcionales detectables potencialmente por un detector electroquímico. Las líneas
horizontales indican el intervalo de los potenciales de oxidación o de reducción donde son electroactivos los
compuestos que contienen los grupos funcionales señalados.

Figura 4. Esquema de
un detector
amperométrico de película
delgada para HPLC.

Fluorescencia
Estos detectores para HPLC son semejantes en diseño a los fluorómetros y espectrofluorímetros. En
la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado
perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos emplean una fuente
de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación emitida. Los instrumentos
más sofisticados consisten en una fuente de radiación de xenón y emplean un monocromador de red
para aislar la radiación fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia
probablemente se basarán en el uso de fuentes de laser sintonizables las cuales permitirán una
mayor sensibilidad y selectividad.

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Figura 5. Esquema
de filtro de un detector

fluorométrico.

Una ventaja inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser más de
un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografía de líquidos se
ha aprovechado esta ventaja para la separación y determinación de los componentes fluorescentes
de las muestras.
detector de quimioluminiscencia (CLD)

Un detector de quimioluminiscencia (CLD) es el método estándar de la industria para medir la

concentración de óxido nítrico (NO).

La reacción entre NO y O 3 (ozono) emite luz. Esta reacción es la base de la CLD en la que los fotones
producidos son detectados por un tubo fotomultiplicador (PMT). El voltaje de salida CLD es
proporcional a la concentración de NO.

La reacción productora de luz es muy rápida, por lo que el manejo cuidadoso de la muestra es
importante en un instrumento de respuesta muy rápida. El Cambustion Fast CLD utiliza un sistema de
muestreo único junto con tecnología CLD miniaturizada para brindar tiempos de respuesta de
milisegundos.

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Luz dispersada tras evaporación (ELSD)

En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina
niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotas se llevan a través de un tubo por el que
pasa la corriente del gas a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil,
lo que origina unas finas partículas de analito. La nube de partículas de analito pasa a través de un
haz laser. La radiación dispersada se detecta en dirección perpendicular al flujo mediante un
fotodiodo de silicio.
Una de las mayores ventajas de este tipo de detectores es que su respuesta resulta ser
aproximadamente la misma para todos los solutos no volátiles. Además, es notablemente más
sensible que el detector de índice de refracción, ya que se han establecido límites de detección de 2
ng/μL. La desventaja es que la composición de la fase móvil está limitada solo a componentes
volátiles.

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Figura 5. Componentes de un detector ELSD.

MALS (Multi-Angle Light Scattering)

Un detector de dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) es una forma de
detector de dispersión de luz estática que permite medir el peso molecular
absoluto (Mw) y potencialmente el radio de giro (Rg) de una muestra.
El método más común de usar un MALS es conectarse a un sistema de
cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o cromatografía de permeación en
gel (GPC) de HPLC, como OMNISEC. Como parte de este sistema, es
fundamental que también esté conectado un detector de concentración, índice de
refracción o UV.
El detector SEC-MALS mide la luz dispersada por una muestra en muchos
ángulos y para crear un diagrama de Debye. El diagrama de Debye modela la
dependencia angular de la dispersión de una muestra y se utiliza para determinar
el Mw y el Rg en cada segmento de datos dentro del cromatograma. Es importante
destacar que el orden de ajuste y el modelo elegido para este análisis deben
considerarse cuidadosamente, ya que tendrá un impacto significativo en los
resultados. Los dispersores isotrópicos, de menos de 10-15 nm de radio,
dispersarán la luz de manera uniforme en todas las direcciones, lo que significa
que solo se puede medir el Mw. Las muestras de dispersión anisotrópica, con un
radio de más de 10-15 nm, dispersarán más luz en la dirección de avance, lo que
permitirá medir tanto Mw como Rg. Usando el Rg se puede generar un gráfico de
conformación (gráfico de Rg contra Mw) que permite medir cualquier diferencia
estructural entre muestras.

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Ilustración 1 Esquema del funcionamiento de un detector MALS

ELSD (Evaporative light scattering detector)

es un detector que se utiliza junto con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC),
cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC), cromatografía líquida de
purificación como cromatografía flash o preparativa, cromatografías de partición centrífuga
o contracorriente y Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC). Se usa comúnmente para
el análisis de compuestos donde la detección de UV podría ser una restricción y, por lo
tanto, se usa cuando los compuestos no absorben eficientemente la radiación UV, como
azúcares, antivirales, antibióticos, ácidos grasos, lípidos, aceites, fosfolípidos, polímeros,
tensioactivos, terpenoides y triglicéridos. Los ELSD están relacionados con el detector de
aerosoles cargados (CAD) y, al igual que el CAD, se incluyen en la categoría de detectores
destructivos.
Un detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) es capaz de detectar todos los
compuestos que son menos volátiles que la fase móvil, es decir, compuestos no volátiles y
semivolátiles.
Los ELSD analizan el disolvente después de la elución de HPLC. A medida que el eluyente
pasa de una HPLC, se mezcla con un gas portador inerte y se fuerza a través de un
nebulizador , que separa el líquido en diminutas gotas aerosolizadas. Estas gotas pasan
luego a un tubo de deriva calentado, donde se evapora el disolvente de la fase móvil. Como
la fase móvilse evapora, las gotitas se vuelven cada vez más pequeñas hasta que todo lo que
queda son partículas diminutas de analito seco. Estas partículas son empujadas a través del
tubo de deriva por el gas portador a la región de detección. En esta región, un haz de luz
atraviesa la columna de analito y la dispersión de la luz se mide mediante un
fotodiodo o tubo fotomultiplicador. La salida del detector no es lineal en más de un orden
de magnitud y se requiere una calibración adecuada para el análisis cuantitativo.

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CAD (Charged Aerosol Detection)

El detector de aerosoles cargados (CAD) es un detector que se utiliza junto con la
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la cromatografía líquida de ultra alto
rendimiento (UHPLC) para medir la cantidad de productos químicos en una muestra
mediante la creación de partículas de aerosol cargadas que se detectan utilizando un
electrómetro. Se utiliza comúnmente para el análisis de compuestos que no pueden
detectarse con los métodos tradicionales de UV / Vis debido a su falta de cromóforo. El
CAD puede medir todos los analitos no volátiles y semivolátiles, incluidos, entre otros,
antibióticos, excipientes, iones, lípidos, productos naturales, biocombustibles, azúcares y
tensioactivos. El CAD, al igual que otros detectores de aerosoles (p. Ej., Detectores de
dispersión de luz por evaporación (ELSD) y detectores de dispersión de luz por nucleación
de condensación (CNLSD)), se incluye en la categoría de detectores destructivos de uso
general.
¿Cómo funciona CAD?

Esencialmente, es un proceso de tres pasos: primero, el detector convierte las moléculas de

analito que eluyen de la columna en partículas secas. El número de partículas aumenta
proporcionalmente con la cantidad de analito. En segundo lugar, una corriente de gas cargado
positivamente choca con las partículas de analito. Luego, la carga se transfiere a las partículas:
cuanto más grandes son las partículas, mayor es la carga. Finalmente, las partículas se transfieren

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a un colector donde se mide la carga con un electrómetro de alta sensibilidad. Esto genera una
señal en proporción directa a la cantidad de analito presente.

Ilustración 2Esquema del funcionamiento de un detector Cad

Referencias bibliográficas

Detectores empleados en HPLC. (2015, 11 agosto). Recuperado de

https://cienciaonthecrest.com/2015/08/11/detectores-empleados-en-hplc/

Harris, D. C. (2016). Análisis químico cuantitativo: Reimpresión digital (3a Edición). España,
Barcelona: Reverté.

Skoog, D. A. (2001). Principios de Análisis Instrumental - 5 Edición. México, CDMX: MC Graw

Hill.

Dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) recuperado de

https://www.malvernpanalytical.com/es/products/technology/light-scattering/multi-angle-light-
scattering

Cinco razones para utilizar la detección de aerosoles cargados. (2018, 15 de junio). Recuperado de
https://analyteguru.com/five-reasons-to-use-charged-aerosol-detection-cad/

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