Fundamentos y Aplicaciones Analíticas y Separativas de La Inmunofluorescencia y La Citometría de Flujo

Fundamentos y aplicaciones analíticas
y separativas
de la inmunofluorescencia
y la citometría de flujo
Asignatura de Inmunología Unidad mixta

CSIC/UAH
Universidad de Alcalá
Jorge Monserrat Sanz
Objetivos
• 1. Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la
heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune.
• 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo.
• 3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se

realizan mediante la citometría de flujo.
• 4. Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de

flujo.
• 5. Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica.
• 6. Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononucleares

mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos.

Objetivos
• 7. Adquisición en un citometro de flujo.
• 8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantes

del ADN.
• 9. Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo:

Comprender las etapas en el proceso de la información obtenida por
citometría
• 10. Resolución de diferentes problemas clínicos reales.
• 11. Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e

interpretación de intensidades medias de florescencia de células
linfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales.
• 12. Interpretación de los resultados obtenidos.

¿Qué debe ser el alumno al terminar el curso?

• Que después del curso el alumno sea:
1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la

citometría de flujo.
2. Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de
citometría analítica y separativa.
3. Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de
puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones
problemáticas (compensación, flujo)
4. Analizador crítico conocedor de las posibilidades de los software de análisis y
exportación de datos.

Prácticas de Inmunología
• Primer día: Seminarios Interactivos (3 horas):
1. Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo.
2. Aplicaciones de la citometría de flujo.
• Segundo y tercer día:

1. Dos actividades simultáneas (1.5 horas):
- Realización de una separación célular de células mononucleares de sangre periférica.
- Contaje de las células.
2. Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo (1.5 horas).
3. Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica (1.5 horas):
a. Marcaje de superficie.
b. Viabilidad (7add).
c. Anexina V.
• Cuarto día (3 horas):

– Análisis de imágenes de citometría de flujo. Problemas.
Relevancia
1. Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología:
Conocimiento y búsqueda de información de carácter
pronóstico
2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía

de toda la comunidad científica biomédica

Evolución de la citometría multiparamétrica
25 14
24 D
NºColores
12
NºColores
6-12 F
20
17 F
10
Nº de Colores
Nº de Colores
15
12 F 8
11 F
10 8F 6
4F
4F 4
3F
2F
5 2-3 F
Nace 2
0 0
1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006 1989 1990s 1996 1997-98 2004-2005
Evolución Temporal EE.UU Evolución Temporal Nuestro Laboratorio
Nº Artículos trabajando en Citom etría de Flujo

80000 !!!más colores, más información!!!
70000 NºArticulos
60000
!!!Análisis cada vez más complicados!!!!!
NºArtículos
50000
40000
30000 Demanda:
- Nuevas herramientas
20000
10000
0 - Nuevas Estrategias de análisis
1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006
Jorge Monserrat Sanz Evolución tem poral
Heterogeneidad celular en el sistema inmune
T4 T8 NK B Mono Neu
CD45
CD2 CD19 CD14 CD15
CD3
CD56
CD4 CD8
CD45RA CD45RO CD45RA CD45RO CD45RA

Criterios de caracterización de los tipos celulares
• Celulares
– Morfología al microscopio.
• Moleculares
– Genotípico. (Genoma) Recombinaciones somáticas
– Fenotípico (Proteoma) RNA expresado, proteínas.
– Citoma: Análisis estadístico multi-celular.
- Antígenos de diferenciación linfocitaria

Los antígenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores
específicos de líneas, tipos y subtipos celulares.
Para estudiar la heterogeneidad celular

son necesarias técnicas:
• 1. Con resolución a nivel de célula individual
• 2. Que caractericen la célula en función de varias
características (parámetros). X, Y, Z...
• 3. Capaces de realizar medidas en números representativos
de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%
• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y
reducir toda esa información sobre células individuales en
conclusiones
Jorge Monserrat Sanzútiles acerca de las poblaciones celulares.
Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de
la heterogeneidad celular
Granulocitos Monocitos
CD15+ CD14+
Linfocitos
CD3+
Τ2αβ
Τ1γδ
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
0 256 512 768 1024 CD5+
FSC-Height ->
4C5144001
CD5-
Fases de la citometría:
1. Pre-citometría:
1. Anticuerpos monoclonales y sondas:
1. Estudio a nivel tisular
2. Estudio a nivel celular
2. Técnicas de separación celular

3. Técnicas en Inmunofluorescencia
2. Citómetria
(Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular…)
3. Análisis cuantitativo
4. Análisis biológico.
Anticuerpos como herramientas en
investigación
• Ventaja
• Capacidad de reconocimiento muy específica
• Detección muy sensible picomolar
• Inconveniente
• Son invisibles
– Conjugación con moléculas “reporter”
• Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977
• Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica
• Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de
flujo, LSC.
Técnicas de separación celular

- Células en tejidos:
1. Inmunohistoquímica
2. Procesamiento mécanico
3. Separación por mallas y filtros
- Células en disolución:
• Gradientes de densidad:
Medios de densidad constante
Gradientes continuos o discontinuos
• Elutriación centrifuga
• Sorting: - Magnético
- Sorter

Técnica de separación mediante
Ficoll-Hypaque
Tipos de marcajes inmunofluorescentes

Directo 1
Indirecto 1 Biotinado
1
b
b
b
b b b b
b
b
b
b b
2 2

Microscopia de fluorescencia
FUNDAMENTOS DE LA
CITOMETRÍA DE FLUJO

¿Qué es la citometría de flujo?
Amplificación Representación
digitalización y Analisis
Meeting point
FSC
Láser
2- 4º
90º
e luz
d Columna
s
t o re de muestra
etec
D
Flujo
VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de
células individuales (miles).
- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en
la precisión de las medidas.
- A menor tiempo de dedicación mayor productividad.
DESVENTAJAS
La citometría de flujo no aporta información sobre la distribución
espacial de las células estudiadas.


Citómetro de flujo
¿Cómo funciona un citómetro?
• Sistema de flujo
• Dispersión de la luz
• Fluorescencia
• Separación y detección de la luz
• Amplificación
• Corrección de errores: solapamiento espectral y formación
de dobletes
• Digitalización y almacenamiento de la información
SISTEMA DE ABSORCION DE
MUESTRA
AIRE
MUESTRA
FLUJO
MUESTRA
Luz incidente
FSC
90º Luz dispersada hacia delante, α=2- 4º
Luz dispersada lateralmente

y luz fluorescente, α = 90º
Cámara
de flujo
Columna
de muestra
Fluido envolvente
INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ
- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:

- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA
- PROPIEDADES FLUORESCENTES:
- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…)

Luz dispersada a 90 grados
Laser
Detector
Detector de 90º
DETECCION DE LUZ DISPERSADA

HACIA DELANTE (FORWARD
SCATTERED LIGHT, FSC)
SSC
FSC
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia

delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño
Jorge Monserrat Sanz de la célula/particula
DETECCION DE LUZ DISPERSADA
LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,
SSC)
SSC
FSC
El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente

en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en
orgánulos membranosos (granularidad)
Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de

la heterogeneidad celular
Granulocitos Monocitos
CD15+ CD14+
Linfocitos
CD3+
Τ2αβ
Τ1γδ
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
0 256 512 768 1024 CD5+
FSC-Height ->
4C5144001
CD5-
Detectores de fluorescencia
Laser
Detector
Freq
Fluorescencia
Detector de fluorescencia
(PMT3, PMT4 etc.)
FL-2
Fluorescencia
FL-1
FSC

Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Percp
Fluorescencia
• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su
energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.
• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los
distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos
energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.
λ2
λ1
E
λ1<λ2
Jorge Monserrat Sanz t (μs)

Espectros
• Espectro de Absorción
– Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas
las longitudes de onda por una sustancia.
• Espectro de Emisión
– Representación de la intensidad de emisión de una sustancia
excitada con luz de una determinada longitud de onda.
Intensidad de
fluorescencia
medida
excitación

λ (nm)
Fluoresceina (FITC)
Excitación Emisión
300 nm 400 nm Wavelength
500 nm 600 nm 700 nm
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

I n t e n s ti y
l t vi e
Re a
Proteinas
Laseres 350 457 488 514 610 632
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
comunes
PE-TR Conj.
Texas Red
PI
Etidio
PE
FITC
Acido Parinárico
Fluorocromos

Sondas
Proceso de señales
• 1. Separación de señales luminosas
• 2. Detección de señales luminosas

• 3. Amplificación de señales eléctricas
• 4. Corrección de errores
– Compensación de señales
– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).
• 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales

• 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información
resultante
Optica en los citómetros de flujo
PMT
4
Filtros PMT
Dicroicos 3
Flujo Celular
PMT
2
Bandpass
Filtros
PMT
1
Laser
DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA
TC
Fluorocromos PerCP Cy5
QR APC
Detectores FL-1 FL-2 FL-3 FL-4

Amplificación de señales
• Lineal
• (intervalos regulares)
• apropiada para:
– Señales que oscilan en un
rango limitado (0-1.000)
– Con distribuciones con 10 100 200 1 10 20
picos estrechos como el
contenido en DNA.
• Logarítmica
• (intervalos crecientes)
– Cubre un rango más amplio
de variación de la señal (0-
10.000). 10 100 200 1000 10 100 200 1000
Escalas
FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica

Compensación de señales medida
FL-1 FL-2
excitación
• Fundamento Superposición de
espectros de emisión. Parte de
Intensidad de fluorescencia
la señal de emitida por un
fluorocromo es leída por el
detector de otro color
• Concepto sustracción de una
parte de la señal medida en un
color a la señal medida en otro
color
• FL-2 - %FL1
λ
Discriminación de señales debidas a

dobletes (proceso de pulsos)
• Señal analógica (V)
• Altura de señal (H)
• Anchura de señal (W)
V H
• Área de señal (A)
A
W
• En base a la información de área t
y anchura se pueden detectar
dobletes (dos células que pasan
juntas).
2 xW
DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO
DE INFORMACIÓN
N FSC SSC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 TIEMPO
1 2 1 1 1 1 2 1
2 2 1 1 2 3 2 1
3 3 2 3 3 3 3 1
4 4 2 4 1 4 3 1
5 3 1 1 2 1 5 2
6 4 2 1 3 1 5 2
7 2 3 2 1 3 1 2
8 2 8 1 2 4 2 2
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
10000
Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitales
Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado
(almacenamiento multiparamétrico).
PROCESO DE INFORMACION
Histogramas
Jorge Monserrat Sanz Diagramas biparamétricos
Proceso de la información generada
• Representación de la información
• Selección de la información
• Reducción de la información
• De la célula a la población celular
Representación monoparamétrica de datos.

Histogramas. Se representa en cada valor de x
(intensidad de fluorescencia) el número de
células que emiten esa intensidad.
M1

Histogramas
FL-1
SSC
FL-2
FSC
FL-3
Representación biparamétrica en 2D
Diagrama de puntos / dot plot
Representación simultánea -+
de dos parámetros X e Y.
++
FL-2
X representa el valor de la
señal de un parámetro.
Y representa el valor de la
señal del otro. -- +-
Jorge Monserrat Sanz FL-1
Representación 3D
Countour plot / Diagramas de contornos
X, Y más una tercera dimensión.
Una superficie tridimensional

La altura representa el número de
células con una determinada
combinación de ambos
parámetros.
Diagrama de dot plot density

Selección de la información
Gates (Puertas) / ventanas (windows)
Selección de subpoblaciones
definidas en diagramas
monoparamétricos M2
Sitúan los valores límite superior e M1
inferior de un parámetro que

definen a las células de interés.
Gates biparamétricos.
Se pueden utilizar puertas R1
biparamétricas definidas en base a la R3
combinación de los valores de dos

parámetros
Se emplean para estudiar las
características de subpoblaciones R2
celulares R4

Gates lógicos / Puertas lógicas
Pueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente como
criterio para seleccionar las células de interés.
R1
NK
GRANULOCITOS
R7 R3
COMPLEJIDAD CELULAR
TK
R2
MONOCITOS
R6
LINFOCITOS R4
R5
T
R5 and R1
TAMAÑO
¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?
N FSC SSC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 TIEMPO
1 2 1 1 1 1 2 1
2 2 1 1 2 3 2 2
3 3 2 3 3 3 3 3
4 4 2 4 1 4 3 4
5 3 1 1 2 1 5 5
6 4 2 1 3 1 5 6
7 2 1 2 1 3 1 7
8 2 8 1 2 4 2 8
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
10000
Análisis de la información.
Estadisticas
monoparamétricas M2
M1
Histogram Statistics
File: ap-24h.011 Log Data Units: Linear Values

Tube: Panel:
Acquisition Date: 26-Apr-99 Gate: G3
Gated Events: 9917 Total Events: 10000
X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak
All 1, 9910 9917 100.00 99.17 1027.48 827.78 37.34 1113.97
M1 685, 9910 8725 87.98 87.25 1153.33 1139.97 16.01 1144.44
M2 14, 685 1192 12.02 11.92 106.29 79.55 95.61 66.12
Estadisticas biparamétricas +- ++
• Cuadrantes Combinación de dos
umbrales de positividad para dos
parámetros -- +-
• Número de células Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:
• % de células Tube: tube #7

Acquisition Date: 5-Jun-98
Panel: Bronquiris
Gate: No Gate
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
• MFI mean, geo mean Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92
UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05
LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17
LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Estadística por regiones
• Selección libre de un conjunto R2 Microbeads
de combinaciones de valores
correspondientes a dos
Linfocitos
R1
parámetros.
Información generada de una muestra

marcada en triple color
Quadrant Statistics Quadrant Statistics

Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID: Sample ID: Patient ID:
Sample ID: Patient ID:
Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Tube: tube #7 Panel: Bronquiris
Tube: tube #7 Panel: Bronquiris
Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate
Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate
Gated Events: 5000 Total Events: 5000 Gated Events: 5000 Total Events: 5000
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log) X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
Quad Location: 15, 17 Quad Location: 15, 17
Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92 UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92
UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92
UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05 UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05
UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05
LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17 LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17 LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17
LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43 LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43 LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Jorge
DelMonserrat
análisis deSanz
cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12-24 nímeros
Estadísticas/Reducción de la información
parámetros
• Análisis gráfico ofrece
células
información numérica sobre las 9x
poblaciones estudiadas. 20000
• Esta información numérica de

una muestra se representará en
variables
una fila de una matriz de datos caso
• Con la matriz de datos se
obtendrá información estadística
y representaciones gráficas
sobre poblaciones de individuos.
Jorge Monserrat Sanz Población casos Población control

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Fundamentos y aplicaciones analíticas

Asignatura de Inmunología Unidad mixta

Jorge Monserrat Sanz

• 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo.

• 3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se

• 4. Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de

• 5. Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica.

• 6. Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononucleares

Jorge Monserrat Sanz

• 8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantes

• 9. Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo:

• 10. Resolución de diferentes problemas clínicos reales.

• 11. Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e

• 12. Interpretación de los resultados obtenidos.

¿Qué debe ser el alumno al terminar el curso?

1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la

Jorge Monserrat Sanz

• Segundo y tercer día:

• Cuarto día (3 horas):

Jorge Monserrat Sanz

2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía

Jorge Monserrat Sanz

Evolución Temporal EE.UU Evolución Temporal Nuestro Laboratorio

Nº Artículos trabajando en Citom etría de Flujo

Jorge Monserrat Sanz Evolución tem poral

Heterogeneidad celular en el sistema inmune

CD2 CD19 CD14 CD15

CD45RA CD45RO CD45RA CD45RO CD45RA

Jorge Monserrat Sanz

- Antígenos de diferenciación linfocitaria

Jorge Monserrat Sanz

Para estudiar la heterogeneidad celular

2. Técnicas de separación celular

Técnicas de separación celular

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Tipos de marcajes inmunofluorescentes

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Luz dispersada lateralmente

Jorge Monserrat Sanz

INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ

- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

DETECCION DE LUZ DISPERSADA

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia

El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente

Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz t (μs)

Jorge Monserrat Sanz

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz