UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS. PROGRAMA DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I. LABORATORIO PRÁCTICA No. 11
PRESENCIA, PROPIEDADES DE LA ENZIMA CATALASA Y CINETICA
ENZIMATICA EN ALIMENTOS

Mastrodoménico Betancourt Cesar Camilo (201811756); Mora Najar Gabriel Leonardo

(201722825); Rodríguez Hernández Sebastián Felipe (201722513); Rodriguez Patarroyo
Johan Sebastian (201811814).

1. PRELABORATORIO

a. Cuál es el significado Bioquímico de KM y Vmax?

Son dos parámetros fundamentales de la cinética de toda reacción enzimática referentes a:

 KM: Constate de Michaelis-Menden, matemáticamente corresponde a la

concentración del sustrato a la mitad de la velocidad máxima, en términos
bioquímicos se indica que corresponde a un índice de afinidad que da una idea del
comportamiento entre enzima-sustrato, es constante para cada enzima y se da en
unidades de concentración. Asimismo se enuncia que a mayor valor de K M menor
afinidad y que la expresión referida a esta constante corresponde a:

k 2 +k 1
K M=
k1

Ecuación 1: Constate de Michaelis-Menden.

 Vmáx: Velocidad máxima de reacción enzimática, corresponde al momento en que

todos o la mayoría de los sitios activos se encuentran saturados en procesos de
transformación. La expresión para la velocidad máxima es indicada de la siguiente
manera:

V máx =k cat∗[ E]total

Ecuación 2: Velocidad máxima de reacción enzimática.

b. Cuál es la importancia de las enzimas con su participación en las reacciones

bioquímicas de los seres vivos. Explique máximo en 10 renglones

Las enzima en sí corresponden a sustancia biológicas proteica que desempeña un papel

catalizador en los organismos vivos regulando y/o acelerando considerablemente la
velocidad a la cual se desarrollan todas las reacciones que tienen lugar dentro de las células,
sin que esta se vea alterada en el proceso. Son fundamentales en el sustento y normal
funcionamiento de muchos seres vivos, cumpliendo diversas tareas acorde al tipo de
sustancia en cuestión. Algunas enzimas de gran importancia biológica cumplen funciones

1
como: degradación del neurotransmisor acetilcolina en nervios y músculos.
(Acetilcolinesterasa), conversión los almidones en azúcares y se encuentra en la saliva
(Amilasa) digerir las grasas en el intestino (Lipasas), “desenredo” del ADN (Helicasa),
entre otras.

c. En el laboratorio de hoy para que se utiliza ácido sulfúrico, 6N

Se implementa para detener la reacción enzimática, esto a través de la desnaturalización

ácida de la enzima con el fin de asegurar que todas las reacciones sean llevadas a cabo
(terminadas) se den en las mismas condiciones de tiempo y poder así realizar las
respectivas comparaciones.

d. En el laboratorio de hoy para que se utiliza KMnO4

Se utiliza para titular (degradar) las moléculas de agua oxigenada (H2O2) que no
reaccionaron después de la reacción enzimática. De lo anterior, al conocer el
volumen/concentración que se emplea en la titulación respectiva, es posible calcular
variados aspectos de concentración de la misma agua oxigenada y poder así analizar de
mejor forma el fenómeno estudiado.

2. INTRODUCCIÓN

Para la siguiente practica se llevara a cabo la determinación y propiedades de la enzima

catalasa lo cual se llevara a cabo mediante la titulación oxido redox con permanganato de
potasio; cabe resalta que esta determinación se ha llevado a cabo mediante el usos de
métodos instrumentales los cuales reducen el tiempo de análisis pero a nivel de laboratorio
este practica tiene gran interés en el ámbito de la medicina ya que en el análisis de sangre y
de tejidos se lleva a cabo la determinación del nivel de catalasa ya que esta enzima tiende a
destruir el peróxido de hidrógeno generado durante el metabolismo celular. Sus
características estructurales, así como su papel en algunas situaciones fisiopatológicas.

3. REACTIVOS

Tabla 1: Reactivos
Características
fisicoquímicas
Ácido sulfúrico
Aspecto: Transparente
incoloro
Olor: Inodoro en frio, en
caliente picante
pH: Fuertemente acido
Punto/intervalo de
ebullición: 310ºC
Presión de vapor:
Frases R y S
Frases R
R35: Provoca quemaduras graves.
Frases S
S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y
abundantemente con agua y acúdase a un médico.
S45 En caso de accidente o malestar, acúdase
inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la
etiqueta).
S37/39 Úsense guantes adecuados y protección

2
0.001mmHg
Densidad relativa: 1.836
g/cm3 para los ojos/la cara.
Viscosidad: 26.9 (mPa´s) S30 No echar jamás agua en este producto.
Ácido fosfórico Frases R
Aspecto: liquido claro R 34: Provoca quemaduras
viscoso Frases S
Olor: inodoro S1/2 Consérvese bajo llave y manténgase fuera del alcance
pH: 1.5 (0.1N) de los niños.
Punto/intervalo de S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y
ebullición:407°C abundantemente con agua y acúdase a un médico.
Inflamabilidad (sólido, gas): S45 En caso de accidente o malestar, acúdase
No inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la
Presión de vapor: 0.0285 a etiqueta)
20 °C
Densidad: 1.874 g/cm3

Permanganato de sodio Frases R:

Estado físico: Sólido R8 Peligro de fuego en contacto con materias combustibles
Color: Violeta oscuro R50/53 Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede
Olor: Inodoro provocar a largo plazo efectos negativos en el medio
Propiedades comburentes: ambiente acuático
Comburente Frases S:
Densidad relativa (agua=1): S60 Elimínense el producto y su recipiente como residuos
2,703 a 20°C peligrosos
Solubilidad en agua: Soluble .
Peróxido de hidrogeno Frases R
R22: Nocivo por ingestión.
R37: Irrita las vías respiratorias.
Estado físico: Liquido
R38: Irrita la piel.
Color: Incoloro
R41: Riesgo de lesiones oculares graves.
pH: 2.0-4.0
Frases S
Punto de ebullición: 106°C a
S1/2: Consérvese bajo llave y manténgase fuera del
30°C
alcance de los niños.
Punto de fusión: -26°C (30%)
S3: Consérvese en lugar fresco.
Densidad relativa (agua=1):
S17: Manténgase lejos de materiales combustibles.
1.1g/mL a 20°C
S26: En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y
abundantemente con agua y acúdase a un médico.

4. PROCEDIMIENTO

3
 PROPIEDADES CATALITICAS DE
LAS ENZIMAS

Asegurarse de tener los cálculos necesarios Verificar y/o limpiar los implementos de
para el desarrollo de la práctica. laboratorio a utilizar.

Colocar en tres tubos de ensayo trocitos de 1. Demostración de la existencia de

hígado, tomate y papa. la enzima

Anotar y comentar sobre los resultados

Añadir 5mL de agua oxigenada en cada tubo. obtenidos.

Colocar en tres tubos de ensayo 2. Desnaturalización de la catalasa

trocitos de hígado, tomate y papa.

Añadir agua para hervir las muestras y

hervir durante unos minutos. Retirar el agua sobrante.

Anotar y comentar sobre los resultados

Añadir 5mL de agua oxigenada en cada tubo.
obtenidos.

3. Obtención de una solución que Triturar 2g de hígado en un mortero hasta

contiene la enzima catalasa. obtener una pasta fina.

Diluir la pasta con 8mL de buffer fosfato Añadirle 8mL de solución de buffer fosfato
pH= 7,4. pH= 7,4 y moler hasta homogenizar.

Centrifugar la preparación a 2500rpm Decantar el sobrenadante que contiene a la

durante 5minutos. enzima en un tubo de ensayo.

Incubarlo por espacio de 15minutos a

Anotar y comentar sobre los resultados
temperatura ambiente.
obtenidos.

Tomar en un tubo de ensayo 4mL de

4. Actividad y cinética enzimática solución de enzima.

Alistar y rotular 6 tubos de ensayo. Hervirla durante 5min y rotularla.

4
 Agregarles 4,5mL, 4,0mL, 3,5mL, 3,0mL,
Añadirles 0,5mL, 1,0mL, 1,5mL, 2,0mL, 2,5mL 2,5mL y 2,5mL de Agua destilada
y 2,5mL de H2O2 0,1 M respectivamente. respectivamente.

Adicionarles 1,0mL de Enzima no hervida a los

Agitar todos los tubos de ensayo.
tubos 1-5.

Con el método de las velocidades iniciales

Añadir 1,0mL de Enzima hervida al tubo 6.
realizar la reacción enzimática en 5min.

Pasar el contenido de cada tubo a vasos de Agregar a cada tubo 2mL de ácido sulfúrico 6N
precipitados. y agitar.

Titular con permanganato de potasio 0,01 M. Anotar y comentar sobre los resultados
obtenidos.

Realizar los respectivos cálculos,

Fin. observaciones y análisis.

Gráfico 1: Diagrama de flujo.

5. MARCO TEÓRCO

5.1. Desnaturalización:

Considerando los objetivos especificados para el desarrollo de esta práctica de laboratorio,

resulta conveniente dar lugar a una definición más precisa del fenómeno de la
desnaturalización, por ende es descrita como un procedimiento en el cual las proteínas
pierden la estructura cuaternaria/ terciaria/secundaria presente en su estado original, esto a
través de la interacción con condiciones específicas como “algún estrés externo”, adición
de un ácido/base fuerte, una sal inorgánica concentrada, un disolvente orgánico, y
sometimiento a radiación/calor.

Generalmente, son implementadas altas temperaturas para generar la desnaturalización de

proteínas, este proceso genera en la enzima una pérdida significativa de características y
actividad biológica, lo que por lo general hace que la enzima no sea capaz de reaccionar
con su respectivo sustrato como lo haría de forma convencional. Acorde a lo especificado
anteriormente, es presentada la Gráfico 2 como una manera de evidenciar este fenómeno
desde un punto de vista más gráfico:

5
Gráfico 2: Proceso de desnaturalización.

En la imagen anterior es posible identificar tres pasos del proceso de desnaturalización a

través de temperatura, en primer lugar se tiene la proteína funcional con una estructura
cuaternaria, posteriormente cuando se aplica calor altera los enlaces intramoleculares de la
proteína lo que resulta en el despliegue de los aminoácidos.

Profundizando un poco más, las fuentes bibliográficas consultadas indican que las proteínas
desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de modificaciones “desde el cambio
conformacional y la pérdida de solubilidad hasta la agregación debido a la exposición de
grupos hidrófobos”, lo que en sí podría radicar en la interrupción de la actividad celular y
posiblemente la muerte celular para aquellas proteínas de una célula viva.

5.2. Cinética enzimática:

Teniendo en cuenta que la práctica desarrollada pone en prueba la cinética enzimática, se

enuncia que corresponde al “estudio de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas
por enzimas”, aquí se considera que mide la velocidad de reacción y analiza los efectos de
variar las condiciones de la reacción, señalando así que el estudio de la cinética de una
enzima revela el mecanismo catalítico enzimático, consideración en el metabolismo,
control de actividad y cómo inhibidor/activador podría afectar la velocidad. Señalando
también que algunas enzimas que solo tienen un sustrato único no entran en esta categoría
de mecanismos, por ejemplo existiendo en la catalasa un “intermedio enzimático
modificado” resulta en que el mecanismo de esta sea un mecanismo de ping-pong (Sección
5.2.2.2.).

Acorde lo anterior se especifica:

5.2.1. Reacciones de un solo sustrato:

Para aquellas enzimas de naturaleza específica, las cuales solo han de reaccionar con un
sustrato, se tiene que sus mecanismos de sustrato único incluyen diversos compuestos
(como isomerasas, liasas intramoleculares, etc) a los cuales a través de los años se les han
deducido teorías con respecto a su cinética:

5.2.1.1. Cinética de Michaelis-Menten:

Corresponde a la cinética de interés en esta práctica, esta refiere a un modelo muy conocido
de cinética enzimática nombrada en honor a la bioquímica alemán Leonor Michaelis y la
médica canadiense Maud Menten. En esta se resalta que el modelo toma forma de ecuación
6
que describe la velocidad de las reacciones enzimáticas, esto “al relacionar la velocidad de
reacción v (velocidad de formación del producto, [P]) a [S], la concentración de un sustrato
S”. Para esto se toma en cuenta el modelo de una reacción enzimática:

E+ S ↔ ES↔ E+ P

Ecuación 3: Modelo de reacción enzimática.

En esta se indica la existencia de una reacción inicial entre la enzima-sustrato para formar
el complejo enzima-sustrato. De aquí que la velocidad de la reacción enzimática aumente
con el aumento de la concentración de sustrato esto hasta un cierto punto denominado Vmáx,
y a Vmáx el aumento en sustrato no provoca ningún aumento en velocidad de reacción debido
a que no hay más enzima disponible para reaccionar. Así, la velocidad de reacción es
dependiente del complejo y la reacción corresponde a una reacción unimolecular con un
orden de cero.

Tomando en cuenta la complejidad del mecanismo enzimático de:

ES k cat E + P
→

Ecuación 4: Paso de interés de la expresión dada en Ecuación 3.

Es indicada la existencia de “un paso enzimático determinante de la velocidad que permite

modelar esta reacción como un paso catalítico único con una constante de velocidad
unimolecular aparente kcat”. Aquí es dicho que si la ruta de reacción avanza sobre uno o
varios intermedios dicha constante estará en función de varias constantes de velocidad, y
por otro lado cuando se considera una sola reacción elemental será idéntica a una constante
de velocidad unimolecular elemental k2. Con respecto a esto y siguiendo la línea de lo
enunciado anteriormente, se establece la ecuación de Michaelis-Menten, en donde describe
cómo “la velocidad de reacción v0 depende de la posición del equilibrio de unión al sustrato
y de la constante de velocidad k2”, presentando así:

V max∗[ S ]
v 0=
K M +[ S ]

Ecuación 5: Ecuación de Michaelis-Menten.

Esto señalando las equivalencias de las constantes en la sección de pre-laboratorio.

Por último, se destaca esta ecuación de Michaelis-Menten se denomina la base de la

mayoría de las cinéticas enzimáticas de un solo sustrato. De esto se indican supuestos
cruciales que subyacen a esta ecuación:

 No hay inhibición intermedia o del producto, ni alostericidad ni cooperatividad.

7
 Supuesto de estado cuasi-estacionario a saber, en donde la concentración de la enzima
unida al sustrato cambia más lentamente que las de la enzima/producto/sustrato y por lo
tanto el cambio a lo largo del tiempo del complejo se puede establecer en cero.
 Supuesto de que la concentración total de enzima no cambia con el tiempo.

5.2.2. Reacciones de múltiples sustratos:

Asimismo, existen mecanismos específicos para las reacciones con múltiples sustratos,
estas siguen ecuaciones de velocidad complejas en las cuales se describe la forma en que se
unen los sustratos con su respectiva secuencia. En condiciones determinadas, se idealizan
estas estas reacciones cuando la concentración de sustrato A es constante y la del sustrato B
varía, aquí la enzima se comporta como “una enzima de un solo sustrato y una gráfica de v
por [S] da constantes aparentes de KM y Vmax para el sustrato B”. Por otro lado, se tiene que
con un conjunto de mediciones a diferentes concentraciones fijas de A, los datos se puede
utilizar para averiguar el mecanismo de reacción, consideraondo también que “para una
enzima que toma dos sustratos A y B, y los convierte en dos productos P y D” son
mencionados diversos tipos de mecanismos:

5.2.2.1. Mecanismos del complejo ternario:

En estos mecanismos se tiene que ambos sustratos se unen a la enzima (al mismo tiempo)
produciendo un complejo ternario EAB, aquí el orden de unión puede ser aleatorio o puede
ser ordenado con los sustratos unidos en secuencia particular. Según lo mencionado se
indica que algunas enzimas con mecanismos de complejo ternario incluyen: glutatión S-
transferasa, dihidrofolato reductasa y ADN polimerasa.

5.2.2.2. Mecanismos de ping-pong:

Para estos mecanismos se muestra:

E A EA ↔ E ¿ P−P E¿ B E¿ B↔ ED−D E
→ → → →

Ecuación 6: Mecanismos de ping-pong.

Este tipo de mecanismos se pueden elucidar señalando que las enzimas con este mecanismo
pueden existir en dos estados: E y una forma químicamente modificada de la enzima E
*(intermedio). Las fuentes consultadas, refieren que en dichos mecanismos el sustrato se
une y cambia la enzima a E *, teniendo en cuenta de igual forma que “solo después de que
se libera el primer sustrato, el sustrato B puede unirse y reaccionar con la enzima
modificada, regenerando la forma E no modificada”.

5.3. Gráfica Lineweaver-Burk:

Conocida también como gráfica recíproca doble, corresponde a la representación gráfica de

la ecuación Lineweaver-Burk de la cinética enzimática expresada de la siguiente manera:

8
 1

( )( )
∗1
1 K M+ [ S ] KM [ S]
= = ∗
V V max∗[ S ] V max V max

Ecuación 7: Ecuación Lineweaver-Burk.

Esta fue descrita por Hans Lineweaver y Dean Burk, y se tiene que el gráfico es “correcto”
cuando la cinética de la enzima obedece a la cinética ideal de segundo orden, esto
tendiendo una regresión no lineal para sistemas que no se comportan de manera ideal. DE
igual forma, se tiene que el “gráfico recíproco doble distorsiona la estructura del error de
los datos” por lo que por teoría no es una herramienta precisa para determinación de
parámetros cinéticos enzimáticos. Según esto se presenta el Gráfico 3:

Gráfico 3: Ejemplificación Gráfica Lineweaver-Burk.

Contextualizando con las secciones anteriormente enunciadas, se tienen que cuando se traza
un conjunto de curvas v por [S] de una enzima con un mecanismo de ping-pong, se
obtendrá un conjunto de líneas paralelas (trama secundaria). Por otro lado cuando se traza
un conjunto de curvas v por [S] de una enzima con un mecanismo de complejo ternario, el
conjunto de líneas producidas se intersecará.

 Actividad específica.

Por último se enuncia que la actividad enzimática específica es correspondiente al número

de unidades enzimáticas por mililitro dividido por la concentración de proteína en mg/mL,
siendo así que según la teoría se exprese en unidades/mg o nmol/min/mg. Esta es una
medida importante de pureza enzimática. De esta se tiene que el cálculo de la actividad
específica depende del valor de la actividad, por lo que el valor de la actividad específica
establecido depende de la definición de la unidad enzimática, considerando de igual forma
que cuando se obtienen valores por debajo del valor de actividad específica esperado, se
indica que pueden contener impurezas o moléculas de enzimas que se han desnaturalizado.

6. RESULTADOS

6.1 Demostración de la existencia de la enzima

a. Indique el aspecto final en los tubos de ensayo

9
 H T P

b. Complete la tabla en la que indique cualitativamente el orden de actividad

El orden de actividad de los tejidos en forma descendente se lista a continuación:

Tejido Orden de actividad

H 1
P 2
T 3

c. Qué puede concluir respecto del orden de actividad. ¿Explique?

Se observó que el hígado fue el tejido con mayor actividad, la razón de esto se logra
explicar debido a que, según lo reportado en la literatura, la catalasa se encuentra en mayor
proporción en el hígado y riñones, por lo que, al agregarse peróxido de hidrógeno a la
muestra de hígado, dada la gran cantidad de catalasa en este tejido, dicha enzima
reaccionará en gran proporción con el agua oxigenada, lo que se verá reflejado en un gran
burbujeo de la muestra.
Siguiendo esta misma lógica, a partir de los datos experimentales obtenidos, se concluye
que la papa fue el tejido con la mayor actividad después del hígado. El tejido que presentó
la menor actividad fue el tomate lo cual indica que este último tejido es que le presenta la
menor cantidad de enzima catalasa dentro de los tres tejidos estudiados.

6.2 Desnaturalización de la catalasa

a. Observe el resultado y dibuje el aspecto de los tubos de ensayo

H T P
b. Qué puede concluir respecto de la actividad de la enzima, después de someterla
a temperatura?

Cuando una proteína es sometida a temperaturas extremas, ya sean altas o bajas

temperaturas, estas proteínas simplemente pierden su actividad biológica debido a que su

10
estructura molecular se ve malograda. Lo anteriormente mencionado se aplica para este
experimento, en donde, al hervir los tejidos a analizar, las proteínas presentes en éstos
sufrieron un proceso de desnaturalización; para el caso del experimento, la catalasa se
desnaturalizó y en consecuencia, dicha enzima al perder su actividad biológica se hizo
incapaz de catalizar la reacción de dismutación del peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno, como consecuencia, al agregarse el peróxido de hidrógeno a los tejidos
previamente hervido, no se vislumbró reacción alguna en forma de burbujeo de las
soluciones.

6.3 Cinética enzimática

Actividad Enzimática

Tubos 1 2 3 4 5 6
Reactivos mL. mL. mL. mL. mL. mL.
Peroxido de hidrogeno 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 2,5
M
Agua destilada 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,5
Enzima no hervida 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -
Enzima hervida - - - - - 1,0

a. Indique el aspecto de los tubos:

1 2 3 4 5 6

 Cálculos para determinar la cantidad de micromoles de H2O2 en cada tubo

número de moles de sto

M=
V (L) de la solución

número de moles=M∗V ( L)de la solución

- Tubo 1

número de moles=0,1 M∗0,0005 L

número de moles=5 ×10−5 moles

11
 número de micromoles=5 × 10−5 ⋅1× 106

número de micromoles=50 micromoles iniciales

- Tubo 2

número de moles=0,1 M∗0,001 L

número de moles=1× 10− 4 moles

número de micromoles=1 ×10−4 ⋅ 1× 106

número de micromoles=100 micromoles iniciales

- Tubo 3

número de moles=0,1 M∗0,0015 L

número de moles=1,5 ×10−4 moles

número de micromoles=1,5 × 10−4 ⋅1 ×106

número de micromoles=150 micromoles iniciales

- Tubo 4

número de moles=0,1 M∗0,002 L

número de moles=2 ×10−4 mole

número de micromoles=2×10−4 ⋅ 1 ×106

número de micromoles=200 micromolesiniciales

- Tubo 5

número de moles=0,1 M∗0,0025 L

número de moles=2,5 ×10−4 moles

número de micromoles=2,5× 10−4 ⋅1 ×106

número de micromoles=250 micromolesiniciales

- Tubo 6

número de moles=0,1 M∗0,0025 L

número de moles=2,5 ×10−4 moles

12
 número de micromoles=2,5× 10−4 ⋅1 ×106

número de micromoles=250 micromolesiniciales

Los volúmenes de KMnO4 utilizados en la titulación del peróxido para cada tubo fueron:

Tubos 1 2 3 4 5 6

Vol (mL) 0,8 1,8 2,9 4,3 6,2 10

Calculando los micromoles de H2O2 no descompuesto utilizados se obtuvieron los

siguientes resultados:

Tubos 1 2 3 4 5 6

( moles de 20 45 72,5 107,5 155 250

H2O2 no
descompuesto
)

A partir de estos datos se procede a determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno

descompuesto por la enzima catalasa, los resultados obtenidos se presentan a continuación:

Tubos 1 2 3 4 5 6
Reactivos mL. mL. mL. mL. mL. mL.
 moles de H2O2 no 20 45 72,5 107,5 155 250
descompuesta en 5
minutos
 moles de H2O2 30 55 77,5 92,5 95 0
descompuesta por 1,0 ml
de enzima en 5 minutos
Actividad específica de 6 11 15,5 18,5 19 0

13
 la catalasa

a. Haga una representación gráfica de Michaeles y Menten, coloque velocidad de

la reacción en las ordenadas y concentraciones iniciales de sustrato en las
abscisas.

Gráfico de Michaeles y Menten

20

18
Velocidad de Reacción

16

14

12

10

6
50 100 150 200 250 300
Concentraciones inciales de Peróxido de Hidrógeno

b. Calcule en ella Vmax y Km

En base a lo graficado se concluye que la velocidad máxima para este experimento es de 19
µm/min. A partir de este dato de velocidad hallada, se calcula el Km el cual se define como:

V max 19
Km= = =9,5
2 2

c. En otro gráfico realice la representación de la reacción de acuerdo a

Lineweaver y burk. Coloque 1/v en ordenadas y 1/S en las abscisas.

14
 f(x) = 0
R² = 0 Gráfico de Lineweaver y burk
12.04

10.04

8.04
1/Velocidad

6.04

4.04

2.04

0.04
0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02
1/concentración

d. Calcule a partir de ella Vmax. y Km

La velocidad máxima en esta gráfica se calcula a partir del punto de intersección con el eje
de las ordenadas que en este caso corresponde a 0,0526, ahora bien, dado que la gráfica se
está expresando 1/Vmax, despejando la velocidad máxima se tendría que:

1
0,0526=
V max

1
V max = =19 µm/min
0,0526

A partir de la pendiente la cual se define como:

V max
m=
Km

Se procede a determinar el valor Km despejando esta ecuación

V max
Km=
m

15
 19
Km=
7,8434

K m =2,42

¿Qué diferencia hay entre calcular Vmax y Km en los dos casos (Michaelis Menten
respecto de Lineweaver y burk)? ¿Cuál método es más exacto, por qué?

La Vmax en Michaelis Menten corresponde al punto en el cual la velocidad se hace lineal

sin importar el aumento de la concentración del sustrato, mientras que en Lineweaver y
burk, la velocidad máxima corresponde a el punto de intersección con el eje de las
ordenadas. Km en Michaelis Menten corresponde a la mitad de la velocidad máxima, en
Lineweaver y burk Km se calcula a partir de la pendiente de la gráfica.

El método de Lineweaver y burk es el más exacto dado que en este la velocidad máxima se
calcula a partir del punto de intersección con el eje de las ordenadas lo cual otorga un valor
más preciso en comparación con la velocidad máxima hallada mediante la gráfica de
Michaelis Menten.

7. REFERENCIAS

16