CONOCIMIENTOS PREVIOS-práctica 9

1. Realizar un diagrama de flujo del proceso de valoración de una proteína por el

método de Bradford.
es sensible para los residuos de aminoácidos de arginina, triptófano, tirosina,
histidina y fenilalanina.
-Añadir a todos los tubos 5 ml del reactivo de Bradford y agitar en el agitatubos.
- Esperar 10 minutos para que se estabilice el color del complejo.
- Leer la absorbancia a 595 nm (ajustar el 0 de absorbancia con el BLANCO).
-Los métodos directos de cuantificación de las proteínas se basan en algunas
características propias de la estructuras proteicas, como la capacidad de reducir
determinados iones, propiedades del enlace peptídico o el contenido de algún aminoácido
en particular, a partir de estos datos, se puede deducir la cantidad de proteína presente
en la muestra.
El método de Bradford cuantifica los aminoácidos básicos y aromáticos
La curva de valoración de proteínas se calibra con una disolución de albúmina bovina
(BSA) de concentración conocida
-Se basa en la unión de un colorante hidrofóbico, Comassie Blue G-250 a las proteínas.
Soluciones acuosas en presencia de ac. fosfórico tienen un color pardo, pero al
encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul
intenso.
Bajo condiciones fuertemente ácidas, la forma estable del colorante es la doblemente
protonada que absorbe a 465 nm. Mientras que al unirse a proteínas la forma estable es
la desprotonada, de color azul que absorbe a 595 nm.
-se trata de un método espectro métrico, término que engloba a un conjunto de
procedimientos basados en la interacción de la radiación electromagnética con un analito
(el componente de interés que se quiere separar de la matriz).
Además de esto, cabe señalar que se trata de un método de naturaleza colorimétrica, es
decir, que obtiene resultados en base a los colores y su concentración en una solución
concreta. La clave de este conglomerado terminológico se encuentra en el colorante “azul
de Coomassie”, ya que en el método de Bradford se cuantifican los cambios en su
absorbancia según ciertos parámetros. Este colorante se muestra azul en su forma
aniónica, verde en la neutral y rojo en la catiónica.
En condiciones ácidas en la solución, el azul de Coomassie se torna de rojo a azul y, en el
proceso, se une a las proteínas que se quieren cuantificar. Si no hay proteínas en el
medio acuoso, la mezcla permanece de un color marrón, así que es muy fácil detectar la
presencia de estas macromoléculas en primera instancia con esta metodología.
El colorante rojo presenta un espectro de absorción de 465 nm, valor que representa la
radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro de un rango de
frecuencias. En la forma azul aniónica (interaccionando con proteínas), se produce un
cambio en la absorción a 595 nm.
Preparar el espectrofotómetro y comprobar su correcto funcionamiento.
Preparar la solución proteica que se va a analizar. Lo ideal es que dicha muestra
contenga entre 5 y 100 microgramos de proteína por cada 100 microlitros de solución
total. Es obvio que no se sabe la concentración exacta, pero son los valores máximos y
mínimos.
Preparar estándares. No vamos a entrar en sus particularidades por la complicación
química que conllevan.
Añadir a la solución 5 mililitros de reagente y dejarla incubar por 5 minutos.
Medir la absorbancia de la mezcla en el espectrofotómetro a 595 nm.

https://sites.google.com/site/proyectodislipemias/home/iii-fase-experimental/4-
fraccionamiento-subcelular-medida-de-proteinas
Rivera M. 2012 (es.scribd.com) https://es.scribd.com/doc/95768010/Determinacion-de-
Proteinas-Por-El-Metodo-de-Lowry-Y-Bradford
https://psicologiaymente.com/cultura/metodo-bradford
https://www.buenastareas.com/ensayos/Analisis-De-Bradford/2003883.html
(pág. 53) https://books.google.com.mx/books?id=p2BmCezyycsC&pg=PA53&dq=reacci
%C3%B3n+de+bradford&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjd8PG-
37n2AhURJkQIHdbPBckQ6AF6BAgDEAI#v=onepage&q=reacci%C3%B3n%20de
%20bradford&f=false
2. ¿A qué se debe que se puedan realizar reacciones de color en proteínas?
Muchas proteínas son capaces de fijar colorantes en su superficie. La fijación del
colorante va acompañada por un cambio en las propiedades espectroscópicas del mismo
(variación en el máximo de absorción) con el consiguiente cambio de color que da la
formación del complejo frente al colorante no unido a la proteína.
Battaner E., 2012 (pág. 403) https://books.google.com.mx/books?
id=CBeDAwAAQBAJ&pg=PA403&dq=reacci
%C3%B3n+de+bradford&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjd8PG-
37n2AhURJkQIHdbPBckQ6AF6BAgEEAI#v=onepage&q=reacci%C3%B3n%20de
%20bradford&f=false
3. Investigar los diversos métodos que hay para cuantificar proteínas y explicar dos
de ellos.
Método de Lowry. Basado en la cuantificación de grupos fenólicos, que permite valorar el
aminoácido tirosina.
Se basa en la reducción del ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico por el triptófano y la
tirosina, que produce un color azul. La intensidad del color depende de la cantidad de
estos aminoácidos presentes en la proteína.
Método de Biuret. Basado en la reacción coloreada característica del enlace peptídico.
Da positivo al tener proteínas de un grupo -CO-NH-, con una intensidad de color que es
uniforme para todas las proteínas, ya que depende de un grupo común a todas ellas.
Determina la concentración de proteínas totales en suero. Es un método colorimétrico que
se basa en la reacción de los iones de cobre con los enlaces peptídicos de las proteínas,
que producen un compuesto azul-violeta.
Método del bicinconínico. Basado en la propiedad de las proteínas de reducir el ion
cúprico a cuproso.
Método turbidimétrico. Se basa en la precipitación de las proteínas con ácido
tricloroacético o sulfosalicílico, o en la desnaturalización con EDTA y tratamiento posterior
con cloruro de bencetonio. Se emplea para la cuantificación de proteínas en la orina y del
líquido cefalorraquídeo.
* https://blogs.ead.unlp.edu.ar/quimicaorganica/2013/12/03/trabajo-practico-no-6-
aminoacidos-y-proteinas/
* https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20METODOS
%20PARA%20LA%20CUANTIFICACION%20DE%20PROTEINAS.pdf
*https://liceo6.weebly.com/uploads/7/1/5/4/7154339/pr%C3%A1ctico_n%C2%BA2_prote
%C3%ADnas_pos_lab.pdf
González A., 2019 (pág. 177) https://books.google.com.mx/books?
id=oACiDwAAQBAJ&pg=PR228&dq=reacci
%C3%B3n+de+bradford&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwiIlo306bn2AhWsKEQIHYW_CyM4C
hDoAXoECAsQAg#v=onepage&q=reacci%C3%B3n%20de%20bradford&f=false
Gil A., 2010 (pág. 569) https://books.google.com.mx/books?
id=hcwBJ0FNvqYC&pg=PA569&dq=reacci
%C3%B3n+de+bradford&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjd8PG-
37n2AhURJkQIHdbPBckQ6AF6BAgGEAI#v=onepage&q=reacci%C3%B3n%20de
%20bradford&f=false
4. Explicar el fundamento de la reacción de Bradford, ¿Por qué resulta positiva a
proteínas y urea?
- Es un ensayo químico utilizado para identificar azúcares reductores además se la utiliza
también para diferenciar a los azúcares monosacáridos de los disacáridos mediante el
tiempo de aparición del precipitado rojo ladrillo (Cu2O).
https://sites.google.com/site/laboratoriosbioquimica/bioquimica-i/carbohidratos/reaccion-
de-barfoed
--Porque los colorantes forman una unión no covalente muy fuerte con las proteínas,
mediante fuerzas de Van Der Waals e interacciones electrostáticas.
Durante la formación de este complejo químico, el colorante le dona a las porciones
ionizables de la proteína su electrón libre, lo que causa la disrupción del estado proteico
normal. Esto expone ciertas sustancias que podrán generar las uniones previamente
descritas, las cuales permiten la tinción de las proteínas.
Sánchez S. 2021 (psicologiaymente.com) https://psicologiaymente.com/cultura/metodo-
bradford
-El complejo proteína-tinte produce un cambio en la absorción del tinte, siendo este
cambio proporcional a la concentración de proteína en el medio de reacción. Las
proteínas presentan grupos ionizables.
-Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los
residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante azul de Coomasie. La
absorbancia se lee a 595 nm y la intensidad de la absorción depende del contenido de
aminoácidos básicos y aromáticos.
-Unión de un colorante azul brillante Coomassie G-250 a las proteínas. Este colorante
existe en una solución ácida en dos formas (una azul y otra naranja). Las proteínas se
unen a la forma azul y forman un complejo proteína-colorante con un coeficiente de
extinción mayor al del colorante libre. Es un método sensible para proteínas con residuos
(arg, trp, tyr, his y Phe).
Método sensible (1-15 microgramos de proteína), las únicas sustancias que pueden
interferir son detergentes y soluciones básicas. El cambio en la absorbancia a 383 nm es
proporcional a la concentración de la proteína en la muestra. Y se monitorea midiendo el
incremento de absorbancia.
Principio: El color rojo pasa a azul cuando se une a la proteína. La formación del complejo
colorante-proteína toma aproximadamente 2 minutos y permanece estable por 1 hora,
este complejo tiene un alto coeficiente de extinción molar lo que hace al ensayo mucho
más sensible.
Méndez O., 2015 (es.scribd.com) https://es.scribd.com/doc/291522763/Metodo-de-
Bradford-Fundamento
UDLAP (catarina.udlap.mx)
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lqf/mundo_a_jn/apendiceB.pdf
(pág. 41) https://books.google.com.mx/books?id=ZeZAAQAAQBAJ&pg=PA41&dq=reacci
%C3%B3n+de+bradford&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjd8PG-
37n2AhURJkQIHdbPBckQ6AF6BAgHEAI#v=onepage&q=reacci%C3%B3n%20de
%20bradford&f=false
5. ¿Cómo se preparan los reactivos de Esbach y de Millon?
Reactivo de Esbach. Se añaden 10g de ácido pícrico y 20g de ácido cítrico en 1L de
agua destilada.
Se realiza la mezcla de una solución acuosa de ácido pícrico al 1% y una solución de
ácido cítrico al 2%.
Reactivo de Millon. Calentando se disuelven 10g de mercurio en 10mL de ácido nítrico
concentrado, la solución resultante se diluye con 40mL de agua destilada.
Reactivo de Millon es nitrado de mercurio II, Hg(NO3)2 en soluciones nitroso-nítrica. Si al
tratar una solución de proteína con el reactivo de Millon se produce un coágulo blanco,
que por calentamiento pasa a rojo carne es porque tiene restos de tirosina.
Moreno A., 2010 (es.scribd.com) https://es.scribd.com/doc/43917188/Manual-de-
Preparacion-de-Reactivos
Cincunegui M., 2017 (clubensayos.com) https://www.clubensayos.com/Ciencia/Extracci
%C3%B3n-de-la-caseina-Qu%C3%A9-es-la-case%C3%ADna/4088878.html
El curioso, 2021 (elgencurioso.com) https://www.elgencurioso.com/diccionario/prueba-de-
esbach/
Galiano A., 2010 (es.mediclopedia.es)
https://es_mediclopedia.es-academic.com/17457/reactivo
*6. ¿Qué es la gelatina y cómo reacciona en la presencia de ácidos, bases o el
reactivo de Esbach?
-La gelatina es una proteína pura, para su elaboración se utiliza la piel de bovinos y
porcinos o huesos desmineralizados de animales, por lo que contiene la proteína de
colágeno.
-La gelatina es un coloide gel (mezcla semisólida a temperatura ambiente), incolora y
traslúcida. Está compuesta por entre un 98 % y un 99 % de proteína proveniente del
colágeno y entre un 1 % y un 2 % de sales minerales.
Es una mezcla de péptidos y proteínas producida por hidrólisis parcial del colágeno
extraído de la piel, el hueso hervido y/o molido y tendones de bovinos y porcinos.
*Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente
a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente (coloide tipo sol) y se solidifican
en agua fría (coloide tipo gel)
GELITA, 2022 (gelita.com) https://www.gelita.com/es/conocimientos/gelatina/que-es-la-
gelatina
Anónimo, 2022 (es.wikipedia.org) https://es.wikipedia.org/wiki/Gelatina
7. Explicar brevemente los tipos de estructura que se pueden encontrar en las
proteínas
Estructura 1ria. El número, la variedad de aminoácidos que componen la proteína y el
orden en el que se disponen dentro de la cadena polipeptídica.
Estructura 2ria. Plegamiento regular local entre residuos de aminoácidos cercanos. La
relación espacial de un aminoácido con respecto al que le sigue es la que determinará el
ángulo de giro que tendrá la proteína. Se puede presentar:
Alfa hélice. La cadena de aminoácidos se tuerce en espiral y permite la máxima
interacción de puentes de hidrógeno dentro de la misma cadena (entre el grupo amino
como donador y el grupo carbonilo como aceptor). Cada vuelta está formada por 3.6
aminoácidos.
Hoja beta. La cadena de aminoácidos no se permite girar por lo que presenta rigidez, la
cadena polipeptídica se mantiene extendida en forma de zigzag y se unen una a la otra
por puentes de hidrógeno. Los polipéptidos presentes pueden alternar su dirección
(antiparalela) o estar orientados en la misma dirección (paralela) pero esta es muy
inestable ya que rompe sus puentes de hidrógeno.
Giros. Permiten conectar elementos de la estructura 2ria e introducir cambios repentinos
de dirección para que los polipéptidos se puedan plegar sobre ellos mismos.

Super estructura secundaria (motivo). Estructura globular con al menos 150

aminoácidos, están dentro de la conformación de la proteína. Tienen una función biológica
específica.
Dominio. Es un motivo que se pliega de forma independiente, se da entre estructuras
separadas de la proteína
Estructura 3ria. Conformación tridimensional completa de la cadena polipeptídica en la
que se reordena la proteína. Se organiza en dominios que comprenden entre 30 y 150
aminoácidos. Presenta puentes disulfuro.
Estructura 4ria. Manera en la que cada cadena polipeptídica de la proteína se arregla en
el espacio en relación con otras cadenas polipeptídicas.
Disposición espacial de la interacción de cadenas polipeptídicas plegadas
independientemente mediante superficies complementarias.
Peretó J., Sendra R., Pamblanco M., Bañó C., 2007 (pág. 59)
https://books.google.com.mx/books?id=TRD112Ay7IUC&pg=PA59&dq=prote
%C3%ADnas+bioquimica&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjvx46D2rn2AhVkD0QIHb-
lDMw4ChDoAXoECAMQAg#v=onepage&q=prote%C3%ADnas%20bioquimica&f=false
Garrido A., Teijón J., Blanco D., Villaverde C., Mendoza C., Ramírez J., 2006 (pág. 91)
https://books.google.com.mx/books?id=avt8LFmp8q4C&pg=PA163&dq=prote
%C3%ADnas+bioquimica&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjvx46D2rn2AhVkD0QIHb-
lDMw4ChDoAXoECAkQAg#v=onepage&q=prote%C3%ADnas%20bioquimica&f=false
Peña A., Arroyo A., Gómez A., Tapia R., 2004 (pág. 77)
https://books.google.com.mx/books?id=EFUP472dyEMC&printsec=frontcover&dq=prote
%C3%ADnas+bioquimica&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=prote%C3%ADnas
%20bioquimica&f=false
3ria https://books.google.com.mx/books?id=r5bedH_aST0C&pg=PA71&dq=prote
%C3%ADnas+bioquimica&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwj4g9KnyLn2AhXRDkQIHVUQC6o
Q6AF6BAgJEAI#v=onepage&q=prote%C3%ADnas%20bioquimica&f=false