Microscopía 2 3° T E O R I C O

La marcación con fluorescencia puede ser con moléculas orgánicas, semiconductores y

también existe la posibilidad de usar la microscopía de fluorescencia en células vivas.

EJEMPLO DE USO DE MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA → se tienen células control y células a

las cuales se les va a agregar el compuesto Tr1-34 → se observará que sucede en las
células control y en las células tratadas.

PRIMER RESULTADO → tanto la célula tratada como la célula control poseen el núcleo rojo.

Con verde se observa la presencia de la proteína Tfx → en las células control, el Tfx se
encuentra en el citoplasma; en la célula tratada → la proteína Tfx se encuentra en el
núcleo. ESTA ES UNA MANERA DE OBSERVAR SI UNA PROTEÍNA SE ESTA MOVILIZANDO
INTRACELULARMENTE ANTE EL TRATAMIENTO DE UN FÁRMACO EXPERIMENTAL (EN ESTE CASO EL TFX) →
SE OBTIENEN LAS FOTOS DE LOS DIFERENTES FLUOROCROMOS Y DESPUÉS SE LOS SUPERPONE .

CÉLULAS CONTROL → núcleo

en rojo; proteína en verde en
el citoplasma.

CÉLULAS TRATADAS → tanto el

fluorocromo verde como el
fluorocromo rojo están en el
mismo lugar espacial → esto
confirmaría que la proteína
se transloco al núcleo →
cuando se superponen las
imágenes → rojo con verde
→ el resultante es amarillo.

Tfx → no está distribuido homogéneamente en todo el citoplasma → está confinado en un

dominio en particular. En este ejemplo no podría saberse → pero se podría marcar otras
organelas con otro color y ver si el verde colocaliza con el azul y de esa manera saber, en
condiciones controles, donde se encuentra el Tfx antes de translocarse al núcleo. SIEMPRE
QUE QUIERO SABER EN QUE ORGANELA O ESTRUCTURA ESTÁ UNA DETERMINADA PROTEÍNA → SE
DEBEN UTILIZAR DIFERENTES MARCADORES Y VER CON QUE MARCADOR CODISTRIBUYE.
 LA PRIMER FILA DE ARRIBA → CÉLULAS
CONTROL; FILAS POSTERIORES → CÉLULAS
TRATADAS.

SE BUSCÓ VER A LA PROTEÍNA β-CATENINA →

que está marcada en verde por
inmunofluorescencia → se quería ver
dónde estaba localizada en las células
control y que le pasaba cuando se
trataba con un determinado compuesto.

IMAGEN DE ARRIBA A LA IZQUIERDA → se usó

Hoeschst → los núcleos están azules y la
β-catenina está en los bordes.

IMAGEN DE ARRIBA AL CENTRO → se utiliza

concanavalina A → la cual es una
lectina que se une a glicoproteínas para
evidenciar principalmente retículo
endoplasmático → se observa en rojo el retículo endoplasmático; y nuevamente en los
bordes la β-catenina en verde.

IMAGEN ARRIBA A LA DERECHA → se utiliza Giantina → proteína específica de la red trans del
Golgi → marca particularmente un grupo de cisternas del Golgi.

LO QUE SE MUESTRA CON ESTE TRABAJO ES QUE → EL TRATAMIENTO HACIA QUE LA PROTEINA β-
CATENINA COLOCALICE CON GIANTINA → EL TRATAMIENTO HACE QUE LA β-CATENINA SE LOCALICE
EN LA RED TRANS DEL GOLGI.

Para poder hacerse una inmunofluorescencia de este estilo → primero se deben fijar las
células → la célula al fijarse pierde la viabilidad → además se debe permeabilizar la
membrana para que pueda ingresar el anticuerpo o el fluorocromo. LAS CÉLULAS, PARA
PODER HACER LA INMUNOFLUORESCENCIA, EN ESTE CASO, DEBERÍA SER NO VIABLES .

Hay casos en que interesa ver la movilización o translocación de la proteína in vivo → con
inmunofluorescencia para este caso particular no sería posible → entonces, lo que se
desarrolló → son las llamadas PROTEÍNAS FLUORESCENTES.
 GFP
La primera proteína bio-luminicente que se utilizó para la microscopía de fluorescencia →
es la PROTEÍNA GFP → la cual fue encontrada en organismos acuáticos. Esta proteína
forma, con 11 láminas beta y con sus aminoácido → un CENTRO CRÓMOFORO → es una
proteína, cuya configuración le permite ser fluorescente. Entonces → la GFP es una
proteína fluorescente verde; pero por diferentes mutaciones y por el estudio de diferentes
organismos → hay proteínas de distintos colores → las cuales permiten marcar diferentes
organelas o diferentes proteínas.

Lo que se debería hacer, si quisiese ver, por ejemplo, a la proteína Tfx verde → SE DEBE
GENERAR UNA PROTEÍNA QUIMÉRICA O UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN ENTRE LA PROTEÍNA DE INTERÉS Y LA
PROTEÍNA FLUORESCENTE (GFP u otra).
La proteína Tfx tendrá en su
estructura primaria a la estructura
GFP.

Lo que uno recibe es un PLÁSMIDO →

es un ADN CIRCULAR. Lo que se hace
es GENERAR UN PLÁSMIDO CON EL GEN
DE LA PROTEÍNA DE INTERÉS, y al lado
tiene el gen de la GFP. CUANDO SE
INCORPORA EL PLÁSMIDO A LA
PROTEÍNA SE EMPIEZA A EXPRESAR LA
PROTEÍNA TFX CON LA PROTEÍNA GFP EN
SU ESTRUCTURA PRIMARIA.

AL PLÁSMIDO SE LO METE DENTRO DE LAS CÉLULAS → se obtiene

una célula conjugada con GFP → es una proteína quimérica
→ es la proteína de interés + la proteína GFP → COMO
RESULTADO SE VERÁ A LA PROTEÍNA DE INTERÉS EN COLOR VERDE.

Algunas células tienen verde y otras que no, ya que → no

todas fueron afectadas con el plásmido. Se podrá
seleccionar solo aquellas células que hayan recibido el
plásmido con la proteína GFP.

ENTONCES → la GFP permite seguir la

movilización de una proteína → se puede
ver como la proteína se mueve gracias a
que se le otorga fluorescencia mediante la
GFP. La proteína GFP puede ser
incorporada inclusive a un organismo.

El microscopio convencional
de fluorescenia suele llamarse
Widefield.
 PROTEÍNA TFX → fluorocromo verde → para excitar este
fluorocromo, que se desexcitará en verde → se lo debe excitar
con una luz de color azul → ya que la luz de color azul tiene una
menor longitud de onda, tiene mayor energía → cuando se
desexcita la molécula emite una longitud de onda mayor, es decir
de menor energía. CUANTO MENOR ES LA LONGITUD DE ONDA →
MAYOR ENERGÍA TIENE ESA ONDA ELECTROMAGNÉTICA.

La luz de excitación es muchísimo más intensa que la de emisión

→ la luz para excitar a una molécula fluorescente se genera con
una lámpara de mercurio y no se pueden mirar directamente al
ojo.

TODA LA LUZ AZUL EXCITATORIA LLEGA JUNTO CON LA FLUORESCENCIA VERDE → sin embargo, el
fondo azul es tan intenso que básicamente la fluorescencia verde de la Tfx no se estaría
viendo (imagen derecha).

Lo que se desea observar es al color verde fluorescente sobre un fondo negro → ya que la
microscopia de fluorescencia genera un gran contraste donde se observa la fluorescencia
de la molécula en un fondo negro → la iluminación de un microscopio de luz transmitida
no podría ser utilizada para hacer microscopia de fluorescencia → se usa algo llamado
EPIILUMINACIÓN.

Epiiluminación
SI SE HICIERA LA MARCHA DE RAYOS EN UNA EPIILUMINACIÓN →
hay una lámpara de mercurio que cuando se calienta
genera mercurio gaseoso → éste mercurio gaseoso se le
aplica una diferencia de voltaje y se genera un arco
voltaico → éste arco voltaico hace que el mercurio emita
con mucha intensidad en todo el espectro visible → lo que
generaría una LUZ CON TODO EL ESPECTRO VISIBLE PRESENTE →
esto pasa por una lente, por un filtro, rebota en una especie
de espejo, va a la muestra → la muestra se excita, se
desexcita, emite, pasa por el objetivo, pasa de nuevo por el
pseudoespejo y llega a la detección.

EPIILUMINACIÓN → EL CAMINO DE LA LUZ DE EXCITACIÓN ES EL MISMO QUE EL CAMINO DE

LA LUZ EMITIDA (hasta un determinado punto); mientras que, en la iluminación
clásica → la luz viene de abajo, pasa la muestra y después llega al ojo.

Camino de luz de
iluminación clásica.
EN LA EPIILUMINACIÓN → la luz ya no llega por un condensador, sino por el mismo objetivo
del microscopio; la luz de excitación va por el objetivo; y la luz emitida va por el mismo
objetivo.

Microscopio de epifluorescencia

FILAMENTO DE MERCURIO SE EXCITA → se le

genera un arco voltaico; y de la
desexcitación del mercurio gaseoso se emite
un haz de LUZ BLANCA → o sea que tiene
todas las longitudes de onda.

El haz de luz se encuentra primero con un filtro

de excitación → de esta luz blanca que
posee todas las longitudes de onda, se filtra
exclusivamente la longitud de onda que
interesa para excitar al fluorocromo en
cuestión (en este caso el verde) → se filtra
una longitud de onda azul, la cual servirá
para excitar al fluorocromo verde → esta luz
pasa por el filtro, sigue → y se encuentra en el camino, con el espejo dicroico → para la
longitud de onda azul, el espejo dicroico se comporta como un espejo → como está a
45°, la luz azul rebotará y saldrá por el objetivo, llegando a la muestra → en este momento,
la luz azul excita al fluorocromo → y este se desexcita emitiendo una longitud de onda
correspondiente al verde → la emisión fluorescente saldrá hacia todos lados → el objetivo
capta el cono de luz emitido por la muestra → la luz verde, que tiene otra longitud de
onda, se encuentra con el espejo dicroico → y para esta longitud de onda, el espejo
dicroico NO ACTÚA COMO ESPEJO → sino que funciona como un vidrio fácilmente
atravesable para la longitud de onda verde → la luz de onda pasa el espejo dicroico y se
encuentra con un FILTRO DE EMISIÓN → ÉSTE FILTRA EXCLUSIVAMENTE LA LONGITUD DE ONDA QUE
SE DESEA OBSERVAR → esto atraviesa nuevamente el ocular, llegando al DETECTOR.

ESTA CONFIGURACIÓN → donde la luz de excitación no puede llegar al

ocular ni al detector → genera imágenes donde se ve exclusivamente
la emisión del fluorocromo de interés.

ENTONCES → UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA TIENE UNA LÁMPARA DE MERCURIO, UN SISTEMA

DE EPIILUMINACIÓN, Y EN EL CUBO SE ENCUENTRAN → EL FILTRO DE EXCITACIÓN, EL ESPEJO
DICROICO Y EL FILTRO DE EMISIÓN.
Que pasaría si quiero observar el
FLUOROCROMO ROJO → se debe cambiar o
rotar el cubo de manera tal que cambie el
filtro de excitación, el espejo dicroico y el filtro
de emisión → ahora ya no filtrará la luz azul,
sino luz amarilla → esta luz amarilla rebota en
el espejo dicroico saliendo por el objetivo
llegando a la muestra → la muestra se
desexcita y la emisión de fluorescencia roja
atraviesa ese espejo dicroico en particular →
pasa por él y por el filtro de emisión → y
finalmente llega al detector. SE PUEDE IR
OBSERVANDO POR SEPARADO CADA UNO DE LOS
FLUOROCROMOS.

TAMBIÉN EXISTEN CUBOS QUE VEN EN SIMULTÁNEO VARIOS FLUOROCROMOS .

LÁMPARA DE MERCURIO GENERANDO LUZ

BLANCA → luz blanca se encuentra con el
cubo (los cubos son intercambiables, se
rotan) → allí se encontrará con el FILTRO DE
EXCITACIÓN, con el ESPEJO DICROICO → la luz
rebotará y saldrá por el objetivo → la
muestra se desexcitará, la luz será tomada
por el objetivo y llegará al espejo dicroico
atravesándolo → finalmente la luz puede ir
a los oculares y verlos con los ojos; o puede
observarse con una cámara de captura en
la cual se toma la foto de la imagen.

SITUACIÓN IDEAL→ irradiar con una luz

determinada, excitar una molécula en punto
determinado → molécula emite y se capta por el
objetivo.

SIN EMBARGO → para que la luz llegue al núcleo de

una célula (por ejemplo) → atravesó toda la
célula → mientras el haz de luz fue atravesando
toda la célula → no excitó solo al fluorocromo de
interés, sino que excitó a todo lo que estaba en el
camino → SUELE GENERAR IMÁGENES CON
FLUORESCENCIA FUERA DE FOCO → fluorescencia que se excitó, que se metió en el objetivo,
pero que no es de la parte de la célula que se quiere observar → ES UTILIZABLE, SIN
EMBARGO HAY 2 MÉTODOS PARA MEJORAR A LA FLUORESCENCIA QUE QUEDA FUERA DE FOCO :

 MÉTODO ANALÓGICO → con lo que se llama microscopio confocal.

 MÉTODO DIGITAL → procesos de convolución y deconvolución.

Microscopio confocal
ES EL MÉTODO ANALÓGICO PARA MEJORAR A LA FLUORESCENCIA FUERA DE FOCO . En el
microscopio confocal no se usa lámpara de mercurio, sino que SE EXCITA CON LÁSER → láser
emite una determinada longitud de onda → llega al espejo dicroico → pasa por el
objetivo y excita a la muestra.

EL MICROSCOPIO CONFOCAL RECOGE EXCLUSIVAMENTE LA EMISIÓN QUE PROVIENE DEL PUNTO DE

FOCO DESEADO → solamente pasará la fluorescencia proveniente de ese punto particular
→ ELIMINANDO LA FLUORESCENCIA FUERA DE FOCO.

Además, este microscopio

permite sacar fotos a diferentes
alturas de una célula → se
puede ir sacando fotos de
diferentes planos.

Se obtienen fotos de la célula a diferentes alturas → se puede hacer un análisis de las

diferentes partes → PERMITE RECONSTRUIR A LA CÉLULA EN 3 DIMENSIONES.

Microscopio multifotónico → es una variación

del confocal.
CONFOCAL → se excita con un láser a una
determinada longitud de onda (488nm).
Solamente se va a recolectar el punto focal
de interés, sin embargo, se excita a toda la
muestra, ya que el haz del láser pasa por toda
la muestra. Si bien uno elige el plano focal, la
fluorescencia restante de las otras moléculas
que no son de interés → puede llegar a
meterse dentro del detector.
Segunda imagen → para lograr la excitación del fluorocromo verde, en este caso, se
necesita entregar una longitud de onda específica. MICROSCOPIO MULTIFOTÓNICO → en vez
de mandar un único haz de luz con la energía exacta → MANDA DOS HACES DE LUZ CON LA
MITAD DE ENERGÍA → los dos haces de luz se encuentran en un único punto → ÚNICAMENTE
PUEDEN EXCITAR CUANDO SE ENCUENTRAN EN UN ÚNICO PUNTO DETERMINADO DE LA CÉLULA . No
solo recoge la emisión de un punto específico, sino que EXCITA UN PUNTO PARTICULAR DE LA
CÉLULA. AL ENVÍAR DOS HACES DE LUZ CON LA MITAD DE ENERGÍA SE ENCUENTRAN EN UN PUNTO
DETERMINADO EL CUAL SERÁ EXCITADO → EN CAMBIO, EN EL CONFOCAL SE EXCITA TODA LA
MUESTRA.

Entonces → el multifotónico
produce una mejor resolución de
imágenes, se observan con más
detalles.

Cuanta más energía tiene una

onda electromagnética → menos
penetrancia tiene. Es decir →
CUANTO MÁS ALTA ES LA ENERGÍA,
MENOS PROFUNDIDAD VA A LOGRAR.

Por ejemplo → en el microscopio confocal utilizo una onda de 480 nm → este haz de luz
puede ingresar hasta una determinada profundidad. En cambio → en el multifotónico, al
tener la mitad de energía cada uno → van a poder penetrar más en la muestra → esto
permite, con el multifotónico, realizar un tipo de microscopia llamada MICROSCOPIA INTRA
VITAL.

Microscopia intra vital

Puedo poner un ratón vivo y

observar por microscopia de
fluorescencia, por ejemplo, el
cerebro del ratón.

SI EL MICROSCOPIO TIENE
MUCHISIMA APERTRA NUMERICA →
LA DISTANCIA DE TRABAJO ES MUY
CORTA → CON LO CUAL NO SE
LOGRARÍA LA PENETRANCIA A PESAR DE ESTAR UTILIZANDO UN MULTIFOTÓNICO . Entonces → para
este tipo de microscopía no solo se utiliza el microscopio multifotónico sino que además se
necesitan ciertos objetivos muy específicos que tienen una buena apertura numérica y
una distancia de trabajo muy larga (milímetros → desde el punto de vista de la
microscopía esto es mucho).
 Convolución
Proceso de convolución → el simple hecho de observar algo → le va a incorporar algo a
esa observación que generará una imagen que tendrá → EL COMPONENTE DEL OBJETO
ORIGINAL + LA CONVOLUCIÓN (o sea, todo lo que aporta la misma observación).

ENTONCES → LA IMAGEN OBTENIDA ES UN PROCESO DE CONVOLUCIÓN DE LA IMAGEN ORIGINAL.

Paisaje → lo que se observa en la

cámara es la imagen de la derecha
→ sufrió un proceso de CONVOLUCIÓN.

Se busca como era originalmente lo

observado → se aplica la
DECONVOLUCIÓN a la imagen
obtenida → para ello se necesita
conocer que convolución provocó el
sistema de observación en primer
lugar.

Se utiliza lo que se llama → FUNCIÓN DE DISPERSIÓN DE UN PUNTO.

Se tiene una imagen de lo que se observa con el microscopio → se la quiere

DOCONVOLUCIONAR → se busca observar en el mismo microscopio, en las mismas
condiciones, algo que yo sepa como es originalmente → en general, se miran esferas en
el microscopio. ENTONCES, SI SE SABE CÓMO ES EL OBJETO Y COMO ES LA RESULTANTE → SE PUEDE
CALCULAR LA FUNCIÓN DE DISPERSIÓN → es decir, QUE LE PASO A ESE PUNTO PARA
TRANSFORMARSE EN LA IMAGEN QUE TENÍAMOS ORIGINALMENTE . Se toma la imagen que se
tenía del microscopio y se le aplica la función inversa → O SEA, A PARTIR DE SABER CÓMO SE
OBSERVÓ LA ESFERA CON EL MICROSCOPIO, SE ASUME QUE LOS MISMOS CAMBIOS QUE SUFRIÓ ESTA,
SON LOS QUE SUFRIÓ NUESTRA IMAGEN ORIGINAL → se aplica el PROCESO DE DECONVOLUCIÓN.

imagen donde la mitad está convolucionada y la otra mitad

está deconvolucionada (imagen exagerada).

CASOS DE EPIILUMINACIÓN → en el
microscopio convencional se
tenía el cubo; en el microscopio
confocal se excita por láser; y en
el microscopio multifotónico los
dos fotones se encuentran en un
mismo lugar para generar la
excitación.
Hay dos técnicas que se utilizan con microscopia confocal principalmente, aunque se
puede usar también con el multifotónico o con el convencional → técnicas de FRET y de
FRAP → ambas técnicas permiten observar algo en particular más allá de la imagen que se
obtiene con la microscopia. AMBAS TÉCNICAS SIRVEN PARA OBSERVACIÓN EN CÉLULAS VIVAS.

FRET
LA TÉCNICA DE FRET → EXISTE UNA TRANSFERENCIA DE ENERGÍA A PARTIR DE LA FLUORESCENCIA
ENTRE DOS FLUOROCROMOS.

Se tiene dos fluorocromos o dos proteínas fluorescentes → donde se tendrá un donador y

un aceptor. El donador se excita a una longitud de onda determinada; la particularidad
que debe existir para que se pueda realizar esta técnica → es que LA EMISIÓN DE UNO DE
LOS FLUOROCROMOS O PROTEÍNAS FLUORESCENTES TIENE QUE SER LA ENERGÍA DE EXCITACIÓN DEL
SEGUNDO FLUOROCROMO O PROTEÍNA.

Dos proteínas → PROTEÍNA X; PROTEÍNA Y.

Si las dos proteínas están alejadas, cuando se

excita a la proteína x con 433nm → emitirá la
fluorescencia 475nm. Si la proteína x e y
interactúan → tanto la proteína x como la y
estarán a una distancia menor a 5nm → entonces
CUANDO SE EXCITE A LA PROTEÍNA CIAN con 433nm
→ SE VERÁ LA EMISIÓN DE LA PROTEÍNA AMARILLA.

A partir del microscopio de fluorescencia → evidencio que dos proteínas se encuentran

muy íntimamente relacionadas de tal manera que las dos proteínas fluorescentes se
encuentran a una distancia menor a 5nm. CON LA TÉCNICA DEL FRET PUEDO SABER SI DOS
MOLÉCULAS ESTÁN A UNA DISTANCIA MENOR A 5NM → CON LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA .

No necesariamente deben ser dos proteínas

distintas → cuando no hace FRET, la proteína va
a tener una conformación; pero cuando ocurre
un cambio conformacional que aproxime las
dos porciones de proteínas fluorescentes →
ocurrirá FRET y lo que se verá es la emisión de la
proteína amarilla cuando se excita a la
proteína celeste.

LA TÉCNICA DE FRET SIRVE PARA EVALUAR POR MICROSCOPIA LA INTERACCIÓN ENTRE MOLÉCULAS O
PROTEÍNAS → Y TAMBIÉN SIRVE PARA VER CAMBIOS DE CONFORMACIÓN DENTRO DE UNA MISMA
PROTEÍNA.
 FRAP
LA TÉCNICA DE FRAP → DEMUESTRA CÓMO SE RECUPERA LA FLUORESCENCIA EN UNA DETERMINADA
PORCIÓN O ZONA DE LA CÉLULA EN FUNCIÓN DEL TIEMPO .

Ejemplo → hay una proteína que está en una organela determinada, ésta proteína está
conjugada con otra proteína fluorescente. Se quiere observar que le sucede a la proteína
in vivo.

SE HACE EL FOTOBLANQUEO → cuando se

irradian fluorocromos o proteínas
fluorescentes con mucha intensidad → se
destruye el centro cromogénico del
fluorocromo, con lo cual deja de emitir
fluorescencia. Entonces → SE VA
OBSERVANDO EN ESA ZONA QUE ES LO QUE
PASA EN EL TIEMPO → SE BLANQUEA UNA ZONA,
QUEDARÁ OSCURA YA QUE NO HAY
FLUORESCENCIA Y SE OBSERVA CUANTO TIEMPO TARDA EN RECUPERARSE LA FLUORESCENCIA → ésta
florescencia que se está recuperando no es de las proteínas fotoblanqueadas sino de la
misma proteína fluorescente que viene de otros lados y volviéndose a incorporar en la
zona.

De esta manera se pude medir → la velocidad de difusión de una molécula, la velocidad

de transporte y la compartamentalización.

ENTONCES → TÉCNICA DEL FRAP → HAY UNA PROTEÍNA FLUORESCENTE, FOTOBLANQUEO A LA MISMA
→ Y OBSERVO CUANTO TIEMPO TARDA O DE DONDE VIENE LA FLUORESCENCIA QUE ESTÁ LLEGADO A
LA ZONA FOTOBLANQUEADA → LO CUAL QUIERE DECIR QUE LA PROTEÍNA ESTÁ EN MOVIMIENTO.

Indicadores
Se pone una molécula, se expresa en la célula → emite fluorescencia
o se vuelve fluorescente cuando, por ejemplo, interacciona con
calcio → se observa cómo se produce una corriente de calcio en un
tiempo cuando se produce, por ejemplo, la fecundación.

Primero es un punto → que es donde se produce la interacción, allí

hay calcio o lo que sea que esté midiendo el indicador. Con el
tiempo esto se va expandiendo en la membrana. ESTO ES UNA TÉCNICA
IN VIVO.
 Microscopia electrónica
En este tipo de microscopía no hay óptica → no hay una lente
de cristal.

El microscopio electrónico TIENE UN LÍMITE DE RESOLUCIÓN MENOR

QUE EL MICROSCOPIO ÓPTICO → con lo cual, EL PODER RESOLUTIVO
ES MAYOR.

Mientras que el microscopio óptico podía llegar a los 200nm →

el electrónico puede llegar a resoluciones que están por
debajo del nivel del átomo (desde un punto de vista teórico).

Límite de resolución = 0.61. λ/AN

λ = longitud de onda de la luz transmitida o de la fluorescencia

emitida por el fluorocromo.

Hay varías estrategias para lograr el aumento del poder

resolutivo (o sea, de disminuir el límite de resolución):

 AUMENTAR LA APERTURA NUMÉRICA.

 DISMINUIR LA LONGITUD DE ONDA DE LA ONDA
ELECTROMAGNÉTICA.

En la microscopia óptica, la longitud de onda esta entre 380-

750nm (espectro visible) → esto permite, teóricamente, llegar a
200nm de límite de resolución.

Microscopio electrónico → utiliza ondas electromagnéticas de menor longitud de onda, o

sea, de mayor energía. EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO UTILIZA UN HAZ DE ELECTRONES QUE TIENE
UNA LONGITUD DE ONDA DE 0,004nm (4 órdenes de magnitud menor que la longitud de onda
utilizada en el MO) → desde el punto de vista teórico, se logra una resolución de 0,002nm
→ cien mil veces menor el límite de resolución comparado con el MO.

SIN EMBARGO → desde el punto de vista práctico, dada la AN que se logra con los
elementos que conforman al ME, y la imposibilidad de corregir muchas aberraciones → en
realidad, lo que se podría lograr con el ME es una resolución de 0,1nm → mil veces menor
respecto del MO.
 La construcción es completamente
diferente → EN EL MO HAY UNA FUENTE DE LUZ
MIENTRAS QUE EL ME TIENE UN CAÑÓN DE
ELECTRONES.

AMBOS TIENEN UNA LENTE CONDENSADORA →

sin embargo, la del ME → es un
electroimán que condensa el haz de
electrones en una muestra (que está sobre
una rejilla) → luego los haces pasan por
una LENTE ELECTRÓNICA (que haría de
objetivo) y por una LENTE PROYECTORA (que
haría de ocular).

Dado que la longitud de onda del haz de

electrones está lejos del espectro visible →
NO ES OBSERVABLE A LA VISTA → con lo cual,
se debe utilizar algo que capture el haz de
electrones y lo transforme en una imagen observable.

Dado que el haz de electrones tiene una altísima energía → si hubiese aire en el camino →
el haz de electrones se vería dispersado por los propios átomos que conforman el aire →
con lo cual, todo está en el vacío → Y COMO LA MUESTRA ESTÁ METIDA DENTRO DE UN VACÍO →
ES IMPOSIBLE HACER MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE CÉLULAS VIABLES → EL ME NO PERMITE LA
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS O TEJIDOS VIVOS → DEBEN ESTAR FIJADAS.

La muestra debe pasar varios pasos de preparación:

 FIJACIÓN (GA y TO4Os).

 DESHIDRATACIÓN.
 Cuanto menor es la longitud de onda → mayor es la energía de la onda
electromagnética → y cuanto mayor energía tiene, menor penetrancia tiene en la
muestra → con lo cual se debe trabajar con SECCIONES de entre 50-100nm →
secciones de tejido muy finas.
 Debido a que en muchos casos, los componentes de los tejidos no son
electrodensos → hay que CONTRASTAR las muestras utilizando metales pesados → al
usar componentes electrodensos → los haces de electrones rebotan y se termina
viendo en negativo a las zonas que no fueron atravesadas por haces de electrones.

Otra forma de preparación de las muestras, para darle

electrodensidad a las mismas → es lo que se llama un
SOMBREADO O REPLICA → lo que se hace es evaporar un metal,
después se le pone una capa de carbón y se elimina la muestra
→ se obtiene una réplica en relieve de la muestra.
HAY OTRA TÉCNICA QUE ES EL MICROSCOPIO CRIOELECTRÓNICO → la muestra no se fija sino que
directamente se congela a muy bajas temperaturas y se observa directamente
congelado; se puede hacer criofractura del tejido para ver moléculas o la configuración
de algunas moléculas.

Tipos de microscopia electrónica

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO → este microscopio

toma los electrones que rebotan y que son dispersados por la
muestra. En este microscopio se presenta un DEFLECTOR →
mueve el haz de electrones para que haga un barrido sobre
la muestra. Y el DETECTOR se encarga de recolectar aquellos
electrones que se dispersan. Se genera una imagen
tridimensional del espécimen.
Imagen de una arteriola.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRASMISIÓN → el espécimen es

atravesado por el haz de electrones. Imagen de una
mitocondria → CON MICROSCOPIA ELECTRÓNICA OBSERVO LA
ULTRAESTRUCTURA.
A modo de resumen