Cultivo celular 4° T E O R I C O

Para abordar el estudio de las células debo determinar QUE QUIERO ESTUDIAR; luego se
debe determinar DÓNDE SE QUIERE ESTUDIAR; a su vez → lo que se desea estudiar → ¿se
desea estudiar en la célula entera o en compartimentos aislados (esto se conoce como
sistema libre de células)?. Una vez sabido todo esto → se debe elegir que metodología se
va utilizar → TÉCNICAS QUE PERMITEN EL ESTUDIO DE LAS CÉLULAS → por ejemplo, si yo quisiese
estudiar la ultra estructura de la célula → podría elegir la microscopía.

SISTEMA BIOLÓGICO DE ESTUDIO → es el sistema del cual yo quiero estudiar alguna

característica celular. El sistema biológico de estudio puede ser:

SISTEMAS BIOLÓGICOS DE ESTUDIO

Libre de células IN VIVO IN VITRO

Aquel que está La muestra se obtiene Todos los experimentos que se

compuesto por los directamente del individuo. realizan fuera del organismo.
compartimentos aislados.
Cuando la muestra se obtiene de un ser
Estos compartimentos vivo se denomina BIOPSIA.
aislados se pueden
obtener a partir de un Si el animal de experimentación fue
procedimiento sacrificado y se obtienen sus órganos o si
denominado se obtiene una muestra de una persona
FRACCIONAMIENTO ya fallecida → se denomina NECROPSIA.
CELULAR.
En el caso de que la muestra sea un
Las células que se órgano entero → ÓRGANO O TEJIDO
mantienen por mucho AISLADO.
tiempo y en gran
cantidad se mantienen Si por ejemplo, de un riñón extraído de
gracias a TÉCNICAS DE una rata, se extraen los túbulos colectores
CULTIVO CELULAR. para su estudio → SON ESTRUCTURAS
AISLADAS.

A partir de una estructura aislada se

podrían separar las células que la
constituyen → se tendrían CÉLULAS
AISLADAS.

Si se requiere de una gran cantidad de

células para el estudio, más que las que
obtuve a partir del órgano → se puede
realizar un CULTIVO CELULAR → para
obtener CÉLULAS EN CULTIVO.
 CULTIVO CELULAR → es un conjunto de técnicas que permiten el crecimiento y el
mantenimiento de las células fuera de un organismo, es decir “in vitro”, preservando sus
propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Estos cultivos pueden realizarse obteniendo la muestra a partir de un animal de

experimentación, de un humano o también se puede cultivar líneas celulares.

Obtención de células para la realización de un

cultivo celular

Para realizar el aislamiento de células de un tejido → se debe tener en cuenta que tipo de
tejido se tiene.

AISLAMIENTO DE CÉLULAS DEL TEJIDO

Consistencia líquida Consistencia sólida

Se puede tener un tejido cuya
consistencia sea líquida → por
ejemplo la sangre o la médula
ósea.
MANERAS DE SEPARAR CÉLULAS DE UN
TEJIDO LÍQUIDO:
Centrifugación en gradiente
Una vez que se tiene a la célula aislada → se la
recoge en un TUBO DE TIPO EPPENDORF → una vez
que éste es centrifugado, las células que
sedimentaron quedan al fondo (se denomina a
esto PELLET); el líquido que queda por encima
de las células es denominado SOBRENADANTE →
se descarta el sobrenadante y se queda con el
pellet → se lo traslada a un recipiente para
poder realizar el cultivo celular.

TUBOS TIPO FALCON → se agrega una sustancia llamada Ficoll-Paque → cuando se

centrifuga a esta sustancia, es capaz de formar gradiente. En general se pone en el
tubo, arriba de la muestra de Ficoll, la sangre completa y luego se la centrifuga →
luego se observa que → la muestra se separó y los glóbulos rojos que están en mayor
cantidad y son más pesados van hacia el fondo del tubo; en la mitad del tubo se
encuentran los glóbulos blancos; y la parte superior, que no pudo penetrar el gradiente
→ es el plasma. CON ESTE PROCEDIMIENTO SE PUEDEN SEPARAR DISTINTOS TIPOS DE CÉLULAS.

Afinidad e imanes (DYNABEDS)

Dentro de la franja de glóbulos blancos hay 5 tipos celulares → si

solo quisiese cultivar monocitos → debería separarlos mediante la
técnica de afinidad e imanes. ESTA TÉCNICA SE UTILIZA TANTO PARA
SEPARAR CÉLULAS COMO PARA SEPARAR MOLÉCULAS O
COMPARTIMIENTOS CELULARES. En el PRIMER TUBO → se tiene, por
ejemplo, la mezcla de glóbulos blancos obtenida en la
centrifugación. Cada célula presenta, en su superficie, proteínas o
moléculas que son típicas y únicas de cada tipo celular → a esto se
lo denomina ANTÍGENO DE SUPERFICIE. Se agrega al tubo bolitas
magnéticas
magnéticas → ÉSTAS BOLITAS ESTÁN UNIDAS A UN ANTICUERPO DIRIGIDO CONTRA EL ANTÍGENO DE SUPERFICIE
ESPECÍFICO DE LA CÉLULA QUE SE QUIERE SEPARAR, en este caso monocito.

ENTONCES → se agrega la bolita con el anticuerpo específico → una vez que la bolita con su
anticuerpo entra en contacto con las células → el anticuerpo reconocerá con alta especificidad
por complementariedad molecular al antígeno de superficie. De esta manera, siguiendo con el
ejemplo → todos los monocitos quedarán unidos al anticuerpo que a su vez tiene unida la bolita
magnética. AL FINAL DEL PROCEDIMIENTO → se aplica un imán potente sobre la superficie del tubo y
donde esté éste quedaran adheridas todas las células que hayan sido unidas por las partículas
magnéticas con el anticuerpo. En la solución quedarán aquellas células que no contenían el
antígeno. DYNABEDS ES UNA MARCA DE BOLITAS MAGNÉTICAS.

Citrometría de flujo (FACS)

Otra manera en que se podrían separar monocitos de la
solución de glóbulos blancos → sería utilizando la
citometría de flujo → ES LA SEPARACIÓN DE CÉLULAS
ASISTIDAS POR FLUORESCENCIA.

En ese caso → hay que marcar al linfocito con el

anticuerpo, que en este caso será fluorescente. En la
mezcla de linfocitos y monocitos se tendrá a los
monocitos que no estén marcados (azules) y los que sí lo
estén (verdes) → la mezcla de estos será introducida en
un aparato llamado CITRÓMETRO DE FLUJO → atravesaran
láseres que podrán detectar la emisión fluorescente y
permitirán la separación a través de la marcación de la
célula con fluorescencia → el pasaje a través de los
láseres produce la separación de aquellas células que
poseen fluorescencia de aquellas que no. LAS CÉLULAS
QUE TIENEN EL FLUORESCENTE SON LAS DE INTERÉS .

Ya sea que se utilice citometría de flujo, afinidad por imanes o centrifugación → todas son
maneras de separar distintos tipos celulares de un tejido líquido.

AISLAMIENTO DE CÉLULAS DE TEJIDO CON

CONSISTENCIA SÓLIDA
A PARTIR DE UNA BIOPSIA O UNA NECROPSIA → se pueden obtener tejidos, órganos o fluidos →
a partir de estos se pueden obtener determinados tipos celulares → a los cuales se les dará
condiciones de cultivo → y ese cultivo que se propagara dentro del material de cultivo en
condiciones adecuadas → se denominará CULTIVO PRIMARIO ya que las células que se
están cultivando fueron obtenidas en forma directa del organismo vivo (o un organismo
recientemente fallecido) que se busca estudiar.

VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DE CULTIVO → número de

divisiones que llevan a cabo las células por unidad
de tiempo. Representado en función de las
generaciones celulares.

CUANDO SE PONEN CÉLULAS OBTENIDAS A PARTIR DE UN

ORGANISMO, O SEA, UN CULTIVO PRIMARIO → en las
primeras generaciones, la velocidad de división es
muy elevada → el número de divisiones de esas células por unidad de tiempo es muy alta
→ FASE I. Llega un momento, a una determinada generación, donde la velocidad de
división disminuye y se mantiene constante a lo largo de un gran número de generaciones
celulares → a este momento se lo denomina FASE II. Luego, las células disminuyen
rápidamente la capacidad de rapidez de división → FASE III → a este proceso por el cual
la velocidad de división disminuye se lo denomina SENESCENCIA REPLICATIVA.

Senescencia replicativa

 es un proceso en el cual la velocidad de división de la célula disminuye → ojo, NO

SIGNIFICA QUE LA CÉLULA SE MUERA → SINO QUE TIENE BAJA CAPACIDAD DE DIVISIÓN; los
órganos, en edad adulta, están casi todos en senescencia replicativa.

 La senescencia replicativa es un FENÓMENO QUE SE OBSERVA TANTO IN VIVO COMO IN

VITRO → se inicia cuando las células alcanzan el LÍMITE DE HAYFLICK → es el número de
duplicaciones que puede sufrir la célula antes de alcanzar la senescencia → 50
divisiones o generaciones.

 En este proceso → LA CÉLULA QUEDA PERMANENTEMENTE DETENIDA EN LA FASE DEL CICLO

CELULAR G0/G1 → no responderán a los mitógenos → son sustancias que estimulan la
división celular. La célula no podrá ingresar a la fase S para la duplicación del ADN y
por lo tanto no se puede dividir.

 La senescencia se asocia al acortamiento de los telómeros.

REPRESENTACIÓN DE UN CROMOSOMA DUPLICADO →
ya pasó la fase S del ciclo celular. Hay partes del
cromosoma que están formadas por ADN
altamente repetitivo → el CENTRÓMERO y los
TELÓMEROS → éstos últimos son las secuencias d
AND que se encuentran en los extremos del
cromosoma. Una de las funciones de los
telómeros es “cerrar” el cromosoma → tener en
el extremo, donde termina la secuencia de
genes, una secuencia de ADN altamente
repetitivita no codificable → protege la
estabilidad del cromosoma.

EN CADA DIVISIÓN → la longitud de los telómeros se acorta → esto debido al mecanismo de

acción de la ADN-POLIMERASA habrá una cadena que quede sin su hebra complementaria
→ para solucionar y evitar que se acorten los telómeros existe la enzima TELOMERASA →
ésta es una transcriptasa reversa que utiliza un molde de ARN y → luego de la duplicación
del cromosoma, aquellos extremos que hayan quedado más cortos serán reparados por
la telomerasa → de manera que si el ADN es reparado y su longitud no se acorta, la célula
puede seguir dividiéndose ya que sus cromosomas pueden seguir duplicándose y
manteniendo la información genética.

SIN EMBARGO → la actividad de la telomerasa es muy alta en las personas jóvenes; pero a
medida que avanza la edad → la actividad de la telomerasa disminuye → y por ello,
disminuye la longitud del telómero → ya que no puede ser reparado → entonces, en cada
división celular se acortan. Para poder proteger el ADN que se encuentra en cada
cromosoma → AL DISMINUIR LA ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA, LA CÉLULA ENTRA EN UN ESTADO
SENESCENTE → DEJA DE DIVIDIRSE.

POR OTRO LADO → al dejar de

dividirse, las células quedarán
detenidas en la transición G0/G1
del ciclo celular.

CICLO CELULAR → la célula pasa la

mayor parte de su vida en
interfase (período del ciclo
donde la célula no se divide, no
entra en mitosis) → la célula
cuando no se divide está en la
transición G0/G1.

CUANDO LA CÉLULA RECIBE EL ESTÍMULO ADECUADO → comienza la duplicación del ADN en la

fase S; terminando la fase S se tiene al cromosoma duplicado → cromosoma con dos
cromátides. L
LA FASE DE LA MITOSIS ES LA FASE M → acá se dividen los núcleos celulares y cada núcleo
celular recibe una cromátide hermana de los cromosomas que se duplicaron.

CUANDO LA CÉLULA QUEDA EN FASE G0/G1 → los cromosomas quedan allí en la célula; y las
células no se vuelven a dividir. Para que las células pudieran dividirse deberían ser
responsivas a señales desde el extracelular, a los MITÓGENOS → que serán SUSTANCIAS
CAPACES DE ACTIVAR EL CICLO CELULAR .

Los mitógenos activarán el ciclo celular a través de vías de señalización que van a
provenir desde el exterior celular y llegaran hasta el núcleo celular activando una serie de
mecanismos que permitirán a la célula que pase de la fase G0 a la fase G1 → y entre
nuevamente en el ciclo celular.

QUE LAS CÉLULAS PIERDAN LA SENESCENCIA Y READQUIERAN LA CAPACIDAD DE DIVISIÓN → se las

denomina líneas celulares. Las líneas celulares pueden ser consecuencia de una
transformación espontánea; también puede ser que la transformación no sea
espontánea. Las células que se obtienen espontáneamente o por manipulación → no son
tumorales → son una línea → lo que se hace es favorecer la división y hacer que no entren
en senescencia replicativa.

Otras células que también son líneas y que también se puede trabajar en ellas son células
de trasnformación oncogénica → tienen su ADN mutado pero se muto dentro del
organismo del cual se obtuvo.

La mayor parte de las líneas celulares son líneas celulares de tejido epitelial o mesenquimal
o embrionario. En general → las líneas celulares se compran.
 Requerimientos para que las células puedan

crecer en cultivo

Para que las células puedan crecer en cultivo se tiene 3 tipos de requerimientos
necesarios.

REQUERIMIENTOS PROPIOS DE LA CÉLULA

 MEDIO NUTRICIO → Se necesita un MEDIO DE CULTIVO → éste ofrece aminoácidos,

glucosa, vitaminas y sales a la célula. El medio de cultivo va a estar a un pH fisiológico
adecuado (entre 7.2 y 7.4) y estará preparado con un agua especial.
El medio de cultivo, habitualmente tiene color rojo, debido al indicador de pH → éste
vira cuando la célula proliferó mucho en el cultivo, este metabólicamente muy activa
y haya liberado al medio de incubación → CO2 → el CO2 hará que el medio vire del
rojo al amarillo → esto es un indicador de que debe cambiarse el medio ya que se le
están acabando los nutrientes; además → puede indicar que el crecimiento del
cultivo en cuanto a la proliferación de las células ha sido muy alto y se debe hacer un
subcultivo.
Para que la célula pueda construir estructura y pueda obtener ATP → se necesita
aminoácidos y glucosa. Al medio de cultivo → debe agregarse, además, SUERO FETAL
BOBINO → no confundirse, éste no es el medio de cultivo, sino que se agrega como un
componente del medio de cultivo. SE NECESITA AGREGÁRSELO AL MEDIO DEBIDO A DOS
FACTORES:
o porque en el medio de cultivo tengo factores de crecimiento (mitógenos) que
estimularan para permitir el pasaje de G0/G1 a la fase S. EL SUERO ES FETAL → lo estoy
obteniendo de un organismo que tiene alta cantidad de factores de crecimiento
para que las células puedan recibir el estímulo adecuado y proliferar.
o Además, el suero fetal bobino → TIENE ÁCIDOS GRASOS → son fundamentales, sin ellos
→ las células no pueden construir membranas → y sin membranas no pueden
dividirse. Los ácidos grasos provienen de las lipoproteínas plasmáticas.

ENTONCES → SI NO SE LE APORTA SUERO FETAL BOBINO AL MEDIO DE CULTIVO → NO SE TENDRÍA

FACTORES DE CRECIMIENTO NI ÁCIDOS GRASOS → O SEA, NO TENDRÍA APORTES PARA LA
CONSTRUCCIÓN DE MEMBRANAS, NI MITÓGENOS.

Otro factor importante → es el AGREGADO DE ANTIBIÓTICO → debido al proceso de

manipulación → pueden ingresar bacterias u hongos al cultivo que lo contaminen.
  SUPERFICIE DE CULTIVO → hay dos tipos de cultivos celulares
o unos que crecen adheridos a un soporte, es decir → CRECEN EN MONOCAPA → en
general son las células que provienen de los tejidos sólidos.
o Otros CRECEN EN SUSPENSIÓN → nunca se adherirán al soporte porque en su fuente
original tampoco estaban adheridas. Un ejemplo son las células de la sangre.

AQUELLAS CÉLULAS QUE CRECEN EN MONOCAPA → necesitan, para poder crecer →

tener mitógenos (que vienen en el suero que se agrega al medio de cultivo); necesitan
estar en una densidad adecuada y necesitan generar lámina basal → para que las
células generen matriz extracelular se han generado superficies sólidas que pueden ser de
vidrio o de plástico, en las cuales → ese vidrio o ese plástico estará recubierto por una
densidad de cargas o por alguna sustancia inductora de cargas → éstas sustancias con
alta densidad de cargas, INDUCIRÁN QUE LA CÉLULA SINTETICE MATRIZ EXTRACELULAR Y
FAVORECERÁN QUE LA CÉLULA SE ADHIERA AL SOPORTE → una vez que la célula se adhirió al
soporte, la célula tratara de emitir prolongaciones (filopodios) para tratar de establecer
contacto con células vecinas → en ese momento SE ACTIVA LA DIVISIÓN DE LAS CÉLULAS EN
CULTIVO → FAVORECIDA POR LOS MITÓGENOS QUE SE ENCUENTRAN EN EL MEDIO DE CULTIVO .

Si se desea obtener
GRANDES
CANTIDADES DE
CÉLULAS → lo hago
en botellas → ya
que tienen una
gran superficie.

ESTOS MATERIALES DEBEN ESTAR ESTÉRILES → para ello, el material viene esterilizado y separado
en bolsas. Cuando las células crecen en suspensión → también se las cultiva en el mismo
tipo de plástico o vidrio → con la diferencia de que debe ser plástico o vidrio que no haya
sido tratado para células que crecen en monocapa → es un plástico sin tratar → no
necesito una superficie que induzca la generación de matriz extracelular. También, en el
caso de células que crecen en suspensión → se pueden usar tubos para cultivo, como los
tubos de tipo falcon.
CUANDO LAS CÉLULAS CRECEN EN MONOCAPA Y SE AGREGA LAS CÉLULAS AL RECIPIENTE DE
CULTIVO → lo primero que hacen las células es adherirse a la superficie de cultivo gracias a
que ellas comienzan a fabricar matriz extracelular inducida por el recubrimiento que tiene
el soporte de cultivo. Al comienzo → se observaría como en el recuadro 10% → hay una
muy baja densidad de células; CON EL PASO DEL TIEMPO → LAS CÉLULAS COMIENZAN A
DIVIDIRSE Y LA DENSIDAD DE CÉLULAS AUMENTA → se va viendo en los cuadros. Las distintas
densidades que alcanza el cultivo mientras crece → se los denomina distintos grados de
confluencia.

ENTONCES → las distintas densidades nos dan una idea del crecimiento de cultivo → y se
habla de grado o PORCENTAJE DE CONFLUENCIA → el cual da una idea de la densidad de
cultivo.

CULTIVO CONFLUENTE → es aquel cultivo que alcanzo entre el 80% y el 100% de confluencia
→ ocupó prácticamente toda la superficie de la placa de cultivo. Cuando el cultivo
alcanzó entre el 80% y el 100% de confluencia → se dice que el cultivo llegó a confluencia
total o que el cultivo esta confluente. EN GENERAL → cuando el cultivo está confluente, la
velocidad del cultivo disminuye ya que se activa la inhibición de la división celular al
establecerse múltiples contactos entre las células.

CUANDO EL CULTIVO LLEGA A CONFLUENCIA TOTAL → SE DEBE HACER UN SUBCULTIVO.

Los TRANSWELLS es una multicaja de petri; posee unos conos

que tienen una superficie que es un filtro poroso en donde se
siembra la célula. El Transwells permite cultivar células con
condiciones determinadas → PERMITE GENERAR UN AMBIENTE
MUY SIMILAR AL QUE LA CÉLULA TIENE EN SU ÓRGANO DE ORIGEN.

Además → EL TRANSWELLS SIRVE PARA ESTUDIAR LA CAPACIDAD

DE MIGRACIÓN CELULAR.

Cultivo que se divide hasta ocupar toda la superficie → se tiene un CULTIVO BIDIMENSIONAL
→ están a lo largo y a lo ancho del recipiente. Hoy ya hay tecnología que genera que los
cultivos tengan, también, volumen → CULTIVOS TRIDIMENSIONALES → tienen un aspecto
parecido a lo que se esperaría encontrar en el organismo. En general, para cultivos
tridimensionales → se usa una TÉCNICA PARTICULAR → a las células se las crece EN GOTA.
IMAGEN IZQUIERDA → caja de Petri llena de puntitos de medios de cultivo → éstos son gotas.
Lo que se hace en este tipo de cultivos → es en cada gota sembrar una cantidad mínima
(pero adecuada) de células → éstas gotas nunca se adherirán al soporte → ya que la
caja con las gotas se apoyara de manera invertida.

IMAGEN DERECHA → las células están en la gota → pero al no poder estar en contacto con
la superficie de cultivo, las células no se pegan a la superficie de cultivo → comienzan a
aglutinarse entre ellas y empiezan a establecer interacciones entre ellas → de manera tal
que el CULTIVO CREZCA EN FORMA DE ESFERA. ESTE TIPO DE CULTIVOS TRIDIMENSIONALES SE LO
DENOMINA CULTIVO DE ESFEROIDES.

CULTIVO DE ORGANOIDES → son cultivos 3D → pero ya no son de un solo tipo celular, tendrán
diversos tipos celulares. CUANDO SE GENERA EL CULTIVO 3D SE OBTIENE ALGO SIMILAR A UN
ÓRGANO.

Requerimientos de asepsia/EQUIPAMIENTO

Asepsia es el conjunto de procedimientos que impiden la presencia de bacterias, hongos

y virus en el ambiente u objetos. Se debe trabajar en condiciones de asepsia para estar en
condiciones de esterilidad.

EN GENERAL → las condiciones de asepsia y el equipamiento se

encuentran relacionadas. SE DEBE TRABAJAR EN CABINAS DE
SEGURIDAD BIOLÓGICA (comúnmente conocidas como flujos
laminares) → las cabinas tienen una serie de filtros que filtran el
aire que ingresa ellas→ de manera que el ambiente que se
encuentra dentro de la cabina esté en condiciones de
asepsia. Todos los elementos que ingresen a la cabina deben
estar esterilizados para asegurar que se encuentren libres de
microorganismos → todo lo que ingresa a la cabina se rocía
con alcohol 70%.

Existen distintos tipos de cabinas de seguridad biológica:

 DE TIPO 1 → son las que se usan cuando se manipula material, el cual es poco probable
que cause enfermedades. Se utilizan para extraer ARN o filtración de medios.
 DE TIPO 2 → son aquellas que se utilizan cuando el material manipulado puede generar
enfermedades. Se suelen utilizar para trabajar con células tumorales humanas.
 DE TIPO 3 → son aquellas que se utilizan cuando se manipulan agentes biológicos que
pueden llegar a propagarse tanto al operador como a la población.

Por ejemplo → todos los trabajos

del COVID fueron realizados en
cabinas de tipo 2 y 3.
ADEMÁS DE TRABAJAR EN UNA CABINA DE SEGURIDAD SE NECESITAN :

 MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES DE TRABAJO → se los puede esterilizar haciéndolos

pasar por filtros que tengan un tamaño de poro de 0,22 micrones → este es el tamaño
de poros que retienen a los microorganismos como bacterias y hongos. Esta operación
debe hacerse dentro de la cabina de bioseguridad.
 MATERIAL DE LABORATORIO Y DE CIRUGÍA → esterilizados por calor seco, en una estufa de
esterilización; o en una autoclave que es una olla a presión; y otra forma de esterilizar
material es a través de la radiación gamma → mediante esta generalmente se
esteriliza los plásticos para cultivo.
 OPERADOR Y AMBIENTE

OTROS EQUIPAMIENTOS QUE SE REQUIEREN ADEMÁS DE LA CABINA DE BIOSEGURIDAD SON :

 ESTUFA DE CULTIVO → una vez obtenidas las células y puestas en el recipiente con el
medio adecuado → se les debe dar condiciones de cultivo para que proliferen → las
estufas de cultivo mantienen una temperatura de 37°C, tienen una atmosfera que
balancea el oxígeno y el CO2 en el aire que ingresa y mantiene una determinada
humedad en el ambiente.
 MICROSCOPIO INVERTIDO → el revolver está en la parte inferior del microscopio → de
manera tal que el objetivo mirará desde abajo a las células pegadas en el recipiente
sobre la platina.
 TANQUES DE NITRÓGENO → se los necesita para almacenar las células de cultivo. El
congelamiento de las células es secuencial → se las pone en un dispositivo y la
temperatura va bajando un grado cada determinado período de tiempo → cuando
se alcanzan los -130°C las células son llevadas al tanque de nitrógeno.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL CULTIVO CELULAR

Ventajas

 Obtención de grandes cantidades de células.

 Obtención de poblaciones genéticamente homogéneas (clones).
 Se puede realizar la manipulación genética.
 Se puede estudiar la capacidad de diferenciación.
 Se puede dar a los cultivos condiciones experimentales controladas.
 Se puede criopreservar un cultivo.

Desventajas

 Por más que se pueden obtener poblaciones genéticamente homogéneas → en

algún momento y a lo largo de los pasajes → puede haber una inestabilidad
genética lo que puede llevar a una variación del genoma.
  No están en las mismas condiciones que en el organismo → tienen perdida de la
relación de la célula con la matriz extracelular y perdida de la relación de las
células con sus células vecinas y con los factores humorales endócrinos provistos por
el organismo.
 Las células pueden sufrir desdiferenciaciones o transdiferenciaciones.

Fraccionamiento celular
El fraccionamiento celular es un CONJUNTO DE TÉCNICAS QUE PERMITE TENER FRACCIONES
ENRIQUECIDAS O PURAS DE COMPARTIMIENTOS CELULARES . La separación se lleva a cabo a
partir de ciertos protocolos que utilizan como método separativo, fundamentalmente → a
la centrifugación. Hoy en día → a través de los dynabeds se separan vesículas celulares.

EL FRACCIONAMIENTO CELULAR CONSTA DE DOS PASOS:

Homogeneización Separación

Es la disrupción o ruptura de las Una vez que se tienen todas las

membranas celulares de manera tal organelas en suspensión → la
que la célula libera todo su contenido a separación de las mismas se puede
un medio de homogeneización. llevar a cabo por:

Si se trabaja con CÉLULAS AISLADAS → el  CENTRIFUGACIÓN

proceso se denomina LISADO. a. Sacarosa isotónica
b. Gradiente.
Si se trabaja con TEJIDO U ÓRGANOS → el  AFINIDAD → a través de los imanes
proceso se denomina HOMOGENADO. (Dynabeds).
Existen varios métodos para obtener o
un lisado o un homogenado: La centrifugación, fundamentalmente,
es una técnica de separación →
1. Shock hipotónico. permite SEPARAR O AISLAR PARTÍCULAS QUE
2. Sonicación. ESTÁN SUSPENDIDAS EN UN LÍQUIDO de
3. Congelación-descongelación. manera tal que → luego del proceso
4. Homogenizador mecánico. obtengo un sedimento o pellet y un
sobrenadante. AL APLICAR LA FUERZA
CENTRÍFUGA → AUMENTA UN DETERMINADO
NÚMERO DE VECES LA FUERZA DE GRAVEDAD
→ PARA AYUDAR A QUE LAS PARTÍCULAS
SEDIMENTEN MÁS RÁPIDO.

La “g” indica el aumento de la fuerza de

la gravedad → si centrifugue algo 600 G
→ quiere decir que aumento 600 veces
la fuerza de la gravedad.
Las revoluciones dependen del tipo
de centrifuga del rotor.
Una vez sometida la muestra a la centrifugación → quedan dos partes en el tubo:

 El SEDIMENTO O PELLET → es la parte donde sedimentaron las partículas.

 El líquido que queda por encima del pellet → SOBRENADANTE.

CENTRIFUGA TÍPICA → el rotor es un recipiente donde se introducen los tubos cerrados

(generalmente); rotor de ángulo fijo → el tubo solo se puede poner en una posición →
inclinada con respecto del eje del rotor. Mediante esta técnica se puede centrifugar una
muestra de sangre → la sangre, cuando se centrifuga en determinadas condiciones se
separa en 3 fracciones:

 FRACCIÓN INFERIOR → constituida por los glóbulos rojos → es el PELLET.

 FRACCIÓN MEDIA → constituida por los glóbulos blancos.
 FRACCIÓN SUPERIOR → constituida por el líquido en donde estaban suspendidas las
células, o sea, el plasma → SOBRENADANTE.

Para obtener un hematocrito → se necesita sangre anti coagulada.

Dentro de los tubos → para obtener compartimientos aislados → no se puede partir de

células enteras o de tejidos. Antes de someter a la muestra a una centrifugación se debe
obtener los compartimentos separados → para esto se utilizan los PROCESOS DE
HOMOGENEIZACIÓN.
 Homogeneización

Es la disrupción o ruptura de las membranas celulares → esto permite que el contenido

celular salga al medio de homogeneización. Hay diferentes maneras de lograr esto:

Shock o lisis sonicación Congelación - Homogeneizador

hipotónica descongelación mecánico

Se utiliza un aparato
llamado sonicador Método usado por
Si las células se → emite ondas de Cuando el agua se
congela se excelencia → torga un
someten a una ultrasonido de alta
expande → buen homogenado y
solución cuya frecuenta → estas
produciendo una alta eficiencia de
concentración en producen una
alteraciones en la homogeneización.
solutos es menor a perturbación del
la concentración de líquido de membrana
solutos intracelular homogeneización plasmática.
→ se favorece que → de manera tal Cuando el tejido se
el líquido de la que generan descongela → la
solución fluya desde muchas burbujas → célula está dañada
el exterior hacia el tanto fuera como y libera su
interior → célula dentro de la célula contenido.
expandirá su → estas burbujas
volumen de manera terminan
tal que si la solución generando
está disrupciones en la
adecuadamente membrana celular.
preparada → SE
PRODUCE LA LISIS Si la frecuencia de
CELULAR → se ultrasonido es muy
rompen sus elevada, podría
membranas y libera alterar también las
su contenido al proteínas que se
medio de desea estudiar.
homogeneización.
Este método suele
Este método de lisis usarse en células
suele usarse en células aisladas.
aisladas → y se
somete a las células a
soluciones que tienen
una concentración de
cloruro de sodio inferior
a 130mM o una
Osmolaridad < 280.
 SE REQUIERE DE CIERTO EQUIPAMIENTO PARA HACER UN HOMOGENADO CELULAR.

VASO DE TIPO POTER → en el cual debe entrar un VÁSTAGO cuya

punta es de teflón → encastra perfectamente en el vaso
dejando menos de un milímetro entre el teflón y el vidrio.

La parte de metal del vástago se introduce en una cabeza de

taladro → gira el vástago del homogeneizador → se debe
subir y bajar el vaso que contiene la mezcla de
homogeneización que contiene el tejido que se desea
homogeneizar → luego de este proceso → el tejido se
transformó en un homogenado.

La homogenización se
realiza en una solución de
homogenización → ésta
contiene sacarosa 0,25M → la cual es isotónica. Esta
sacarosa se prepara en un buffer tris-clorhídrico, 25mM;
debe prepararse a un pH de 7,4 a 4°C → ya que el pH
del tris-clorhídrico varía con la temperatura. Además → la solución, generalmente, tiene un
quelante de calcio y magnesio.

Otra cosa que se debe tener además de la solución de homogeneización es hielo → ya

que todo el procedimiento debe hacerse a baja temperatura.

Células o tejido en suspensión

→ se aplica el vástago con cabeza de

teflón para disrumpir la membrana
celular → obteniendo un homogenado
que contiene todas las organelas
celulares. Luego → a este homogenado
se lo lleva a la centrífuga → la
centrifugación es un proceso que
permite separar cosas que están en
suspensión → éstas, ante la fuerza de la
gravedad, descienden formando el
pellet.

SE HACE UNA CENTRIFUGACIÓN → en donde

SE AUMENTA SECUENCIALMENTE LAS
VELOCIDADES DE CENTRIFUGACIÓN → HASTA
QUE EN EL SOBRENADANTE YA NO QUEDEN
COMPARTIMENTOS CELULARES EN SUSPENSIÓN → a esto se lo denomina → CENTRIFUGACIÓN
DIFERENCIAL → ésta es secuencial y se la realiza en sacarosa isotónica → permite obtener
fracciones enriquecidas en algún compartimiento → SON FRACCIONES IMPURAS.
 Centrifugación en sacarosa isotónica

DIAGRAMA DE FLUJO → se lo aplica cuando se

está obteniendo fracciones celulares.

LO PRIMERO QUE SE HACE ES EL HOMOGENADO

CELULAR → luego se centrifuga el tubo con el
homogenado celular (a baja cantidad de
g) → lo cual permite separar lo más pesado;
en el sobrenadante quedarán cosas más
livianas que no lograron sedimentar a esa
velocidad; y en el pellet quedarán núcleos,
células enteras que no se rompieron durante
la homogeneización, citoesqueleto y
grandes extensiones de membrana
plasmática.

LUEGO → al sobrenadante se lo expone

nuevamente al proceso de centrifugación
→ esta vez se aplican más velocidades de g
→ se obtiene un pellet compuesto de
mitocondrias, lisosomas y peroxisomas (y
algún contaminante que puede haber
quedado de la fracción nuclear). A ESTE
PELLET SE LO SUELE DENOMINAR FRACCION MITOCONDRIAL .

A ESTE PELLET SE LO VUELVE A CENTRIFUGAR → nuevamente a una mayor

velocidad de g → se obtienen vesículas de membrana plasmática,
vesículas de retículo endoplasmático y aparato de Golgi, vesículas de
transporte → todo esto constituye la FRACCIÓN MICROSOMAL y a este
pellet se lo denomina MICROSOMAS. LOS MICROSOMAS NO SON UN
COMPARTIMIENTO, SINO UN SEDIMENTO FORMADO POR VESICULAS DE
DIFERENTES COMPARTIMIENTOS CELULARES QUE SE GENERARON COMO UN
ARTEFACTO DE LA TÉCNICA.

Las primeras centrifugaciones se realizan en una centrifuga de ángulo fijo común; la última
centrifugación se realiza en una ultracentrífuga → la cual disminuye la temperatura y
permite hacer vacío → ya que sin el vacío la fricción levantaría temperatura y arruinaría la
muestra.
 Centrifugación en gradiente

Existe otro tipo de rotor → denominado rotor VASCULANTE → con él se

pueden hacer centrifugaciones en gradientes de densidad. Se
coloca, por ejemplo, sacarosa en un tubo → y esta tendrá diferentes
concentraciones a lo largo del tubo. El gradiente puede ser CONTINUO
a lo largo de todo el tubo → e ir variando en cantidades pequeñas; o
puede ser un GRADIENTE DISCONTINUO PREFORMADO.

El homogenado se coloca en una CENTRÍFUGA DE

ROTOR VASCULANTE → se centrifuga durante un
determinado tiempo, en el cual las partículas más pesadas bajarán
una distancia mayor que las partículas más livianas → se dice que se
llega a un EQUILIBRIO EN LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN. ESTE TIPO DE
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE SE DENOMINA “CENTRIFUGACIÓN EN
GRADIENTE POR VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN”.

DE ESTA MANERA → SE PUEDEN SEPARAR BANDAS → Y SE PUEDE OBTENER, POR

EJEMPLO, UNA BANDA DE MITOCONDRIAS PURAS.

CON ESTE TIPO DE CENTRIFUGACIÓN PUEDEN OBTENERSE FRACCIONES PURAS →

podría partir de un homogenado o de la fracción mitocondrial cruda
→ se la coloca en este tipo de gradiente → se lo somete a
centrifugación → y separo mitocondrias, lisosomas y peroxisomas → y obtengo 3
fracciones puras.

Centrifugación de equilibrio de sedimentación

ESTE TIPO DE CENTRIFUGACIÓN NO SE SUELE UTILIZAR
PARA COMPARTIMIENTOS → SINO PARA MOLÉCULAS
→ las moléculas se separan en base a su
densidad → se van a equilibrar con la densidad
que encuentren en el tubo.

Este tipo de gradientes se autoforman en la

centrífuga. Por ejemplo → cloruro de cesio → es
un gradiente que suele usarse para la
separación de moléculas de ADN → en la
medida que se lo centrifuga → éste forma un
gradiente que tendrá distintas densidades a lo
largo del tubo → y las moléculas de ADN se van
a ubicar, de acuerdo a su tamaño y a su
densidad → en una u otra parte del tubo.
 Separación por afinidad (Dynabeds)

Se pueden separar VESÍCULAS Y OTROS COMPARTIMIENTOS

LIVIANOS de los homogenados celulares mediante el uso
de Dynabeds.

En el tubo → hay exosomas → son vesículas formadas

dentro de la célula y luego liberados al extracelular. Las
vesículas van a tener proteínas transmembranas
caracterísricas. Se debe conjugar o unirle a la bolita
magnética, un anticuerpo que reconozca esas proteínas → luego se pone la bolita
magnética con el anticuerpo en el líquido que contiene a los exosomas → las bolitas, a
través del anticuerpo, van a retener al exosoma → y con un imán podré separar todas las
bolitas magnéticas que estarán reteniendo en su superficie a los exosomas → se descarta
el líquido y se queda con las vesículas separadas del resto del homogenado.

Entonces → para el fraccionamiento celular se debe formar un homogenado, y se debe

separar a los distintos componentes del mismo mediante ciertas técnicas que pueden ser
la centrifugación (por sacarosa isotónica o gradiente) o mediante afinidad por imanes.

Caracterización de la fracción

La caracterización de la fracción sirve para saber si obtuvimos lo que estábamos

buscando obtener. PARA PODER CARACTERIZAR LA FRACCIÓN SE DEBE ESTUDIAR, EN LA FRACCIÓN
OBTENIDA, ALGUNA MOLÉCULA QUE SEA CARACTERÍSTICA DE ELLA.

POR EJEMPLO → si yo deseaba obtener una fracción mitocondrial cruda → para saber que
realmente esta es la que obtuve → BUSCO ALGUNA MOLÉCULA QUE SEA CARACTERÍSTICA DE LAS
MITOCONDRIAS → si esa molécula está presente quiere decir que tengo mitocondrias.
TAMBIÉN SE PUEDE BUSCAR LA ACTIVIDAD DE ALGUNA ENZIMA QUE SEA EXCLUSIVA DE LA
MITOCONDRIA → por ejemplo, una enzima del ciclo de Krebs.