REVISANDO LA HISTORIA

En la mitad del siglo XIX, Stokes observ que el mineral Fluospar, fluorescea cuando la luz ultravioleta incidia directamente sobre l Stokes denomin a lo observado fluorescencia En 1930 Haitinger desarroll la tcnica de fluorescencia secundaria empleando un fluorocromo. En 1950 Coons y Kaplan utilizaron los anticuerpos marcados con fluorescena para localizar antgenos en los tejidos(inmunofluorescencia)

La inmunofluorescencia es usada para:

Serotipificacin e identificacin de virus. Deteccin de auto-anticuerpos y otros componentes patolgicos in situ. Identificacin de agentes infecciosos. Cuantificacin de niveles de anticuerpos

El mtodo de inmunofluorescencia se basa en la capacidad que tienen las protenas de unirse a fluorocromos sin alterar sus propiedades inmunolgicas; esto permite observar al microscopio de fluorescencia la formacin de complejos antgeno anticuerpo, si es que en una segunda etapa este complejo se une a un inmunoreactivo ligado a un fluorocromo.

Inmunofluorescencia Directa:
Aplicada fundamentalmente a la deteccin de inmunoglobulinas y factores del complemento presentes en una muestra clnica.

Inmunofluorescencia Indirecta:
Aplicada a la deteccin de anticuerpos especficos en el suero del paciente frente a un determinado antgeno mediante el uso de un segundo anticuerpo, o a la deteccin de un antgeno en una muestra clnica.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
Esta tcnica se vale de un anticuerpo

primario marcado con un fluorocromo que reacciona con el antgeno dentro de la muestra. Es un procedimiento de un solo paso y comprende un solo anticuerpo marcado. La visualizacin de estructuras no es ideal a causa de la poca emisin de la seal.

Esta prueba tiene una sensibilidad mayor que los mtodos directos y con frecuencia recibe el nombre de tcnica del emparedado o de la capa doble. En vez de conjugar un fluorocromo con un anticuerpo especfico dirigido contra el antgeno de inters, el fluorocromo se conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario.

YG

YM YG

Y Y
Y

YD
G

YG

Y Y

YD

Y Y

YG

YM YG

Y Y Y

YG YG
Y G
1 anticuerpo monoclonal no marcado

G M

YG

Y Y Y Y Y

YD

2 anticuerpo policlonal marcado

Y Y Y

YD

YG

Unin antgeno (Ag)-anticuerpo (Ac)

Antgeno: Molcula reconocida como no propia por el organismo, la cual es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria.
Epitopo=determinante antignico

Sitio de unin al antgeno (regin hipervariable)

Anticuerpo: Protena (inmunoglobulina) producida en respuesta a la estimulacin por un antgeno, con el cual reacciona de forma especfica

Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales

Antigeno

Activacin

Linfocitos B

Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos monoclonales

Antgeno

Sangrado

Cultivo de clulas tumorales

+
Purificacin de Linfocitos B

Fusin
Hibridoma

Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos monoclonales

Hibridomas

Screening: Bsqueda de hibridoma positivo y aislamiento

Purificacin de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

Propiedad de algunas sustancias

Luminiscencia o fotoluminiscencia: Almacenar energa luminosa y liberarla posteriormente como energa luminosa
Fosforescencia: Perodos de almacenamiento largo con emisin mucho despus de cesada la excitacin Fluorescencia: Perodos de almacenamiento cortos 10-7 10-9 seg y emisin

FLUORESCENCIA
Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas molculas (fluorforos)

Diagrama Jablonski

1: Excitacin: se entrega un fotn de energa por una fuente externa a un fluorforo que absorbe, pasando a un estado electrnico excitado S1
2: Duracin del estado excitado: existe por un perodo de tiempo finito (tpicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular-

3: Emisin de fluorescencia: Emisin de un Fotn La diferencia de energa es llamada Stokes shift (hEX hEM) que es fundamental para la sensibilidad de las tcnicas de fluorescencia, ya que la emisin del fluorforo permite distinguirse del background.

Generalmente son compuestos heterocclicos o hidrocarbonos poliarmaticos: molculas rgidas (varios niveles a los cuales pueden ser excitados; en el retorno, al no rotar no emite calor y s luz)

Fluorforos

Rodamina 6G

Rodamina B

Isotiocianato fluorescena

Fluorescena Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).

Microscopa de fluorescencia

Principios de marcacin de Ac por sustancias fluorescentes

Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados

Un buen conjugado debe tener: Fluorescencia intensa

Reaccin especfica con los antgenos

Depende de: Calidad y concentracin de los Acs en el suero

Propiedades de la sustancia fluorescente Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople

Tambin influyen: Intensidad de marcacin

Homogeneidad de marcacin

Anticuerpos
Para mayor especificidad utilizar antgenos puros para inmunizar Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales Verificar ttulo de anticuerpos

Intensidad de marcacin
Fluorocromo puede ser conjugado en un nmero variable a cada molcula de protena, resultando diferentes grados de marcacin. Mayor intensidad de marcacin, mayor intensidad Marcacin excesiva: Alteraciones en las propiedades inmunolgicas de los anticuerpos (6 7 molculas de fluorescena/ molcula de Ac es el lmite mximo) disminucin del rendimiento de emisin)

Homogeneidad de marcacin
Altamente marcadas: Fluorescencia inespecfica Medianamente marcadas: Resultados ms satisfactorios Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa

Material:

Guantes Portaobjetos especiales IFI Cubreobjetos 24 x 48mm Jarras Koplin Vasos de precipitado Frasco gotero Papel filtro Micropipetas Tips Tubos de hemlisis Gradillas

Reactivos:
Solucin Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS) Antgeno fijado a portaobjetos Antigammaglobulina Humana marcada con isotiocianato de fluoresceina o conjugado. Azul de Evans Solucin de montaje.

Equipos:

Microscopio de inmunofluorescencia. Estufa de cultivo Heladera Cmara Hmeda

Sacar los portaobjetos con los antgenos de la heladera y dejar que sequen en papel filtro. Diluir los sueros control positivo y negativo en PBS a 1:32. Diluir los sueros problema a partir de 1:16 Colocar una gota de cada una de las soluciones en las divisiones de la placa incluyendo los controles positivos y negativo. Incubar los portaobjetos en cmara hmeda a 37C por 30 minutos Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos. Secar los portaobjetos con corriente de aire fro . Diluir el conjugado de acuerdo a su ttulo en azul de Evans. Colocar una gota del conjugado diluido en cada una de las divisiones del portaobjeto. Incubar los porta objetos en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos. Secar los portaobjetos con corriente de aire fro . Colocar los cubreobjetos con el lquido de montaje.

 Lectura:
Leer en microscopio de inmunofluorescencia. Hacer la lectura de los testigos antes que los sueros problemas. La fluorescencia es particularmente intensa en la membrana del parsito. La dilucin diagnstica para esta prueba corresponde a 1:32 por lo que cualquier ttulo igual o superior se considera como positivo.

Interpretacin:

La IFI como cualquier otra prueba de diagnstico serolgico, no puede ser concebida como un mtodo de diagnstico definitivo, por lo tanto todo resultado debe ser interpretado como una probabilidad mayor o menor de acierto en relacin al caso estudiado dentro de una poblacin normal o parasitada.

LIMITACIONES DEL MTODO

La inexperiencia del personal que realiza el diagnstico puede llevar a la lectura de falsos positivos en el caso de sueros con factor reumatoideo positivo ya que estos dan una fluorescencia mono o bipolar en los parsitos, esto es particularmente evidente cuando el conjugado utilizado es anti IgM o es un conjugado polivalente (GMA). Suelen presentarse reacciones cruzadas con otras parasitosis.

FUENTES DE ERROR

Unas de las principales causas de error de la IFI es que el conjugado fluorescente no este correctamente titulado ya que puede dar lugar a los falsos positivos y falsos negativos. Los lavados durante la realizacin de la tcnica son de mucha importancia ya que as se eliminan las sustancias no ligadas y se evita la inmunofluorescencia inespecfica.

El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones

Son comerciales

Se evita la disminucin de afinidad del Ac 1 Se pueden obtener resultados rpidos. No es necesario realizar cultivos. Se puede identificar microorganismos especficos en un grupo mixto. Determina la identidad de un organismo muerto. Es sensible.

Anticuerpos anti Toxoplasma gondii, agente etiolgico de la toxoplasmosis. El sustrato antignico utilizado es una suspensin de Toxoplasma gondii. Detecta antgenos de membrana

EQUINOCOCCUS GRANULOSUS ANTICUERPOS (HIDATIDOSIS) Mtodo: inmunofluorescencia indirecta (IFI) Muestra: suero.

Inmunofluorescencia indirecta (IFI): Es positiva ms precozmente permanece a ttulos bajos por tiempo prolongado. Utiliza como antgeno T. cruzi fijado en la preparacin, en sus formas tripo y epimastigote. En algunas ocasiones muestran reacciones cruzadas con infecciones por otros protozoarios como los del gnero Leishmania; esta inespecificidad s acenta en los ttulos bajos estas reacciones se eliminan con procedimientos de absorcin. Esta indicada para el estudio del recin nacidos con posible infeccin congnita, se puede detectar IgG e IgM.

Fluorescencia utilizando mas de un Fluorocromo

GRACIAS