TALLER

PCR / PCR EN TIEMPO REAL

Grupo: PD

Nombres:

1. Castillo Viviana Andres Código: ________________

2. Fuentes Ortega Dairy Viviana Código: 2150434

3. Hernández Herrera Erika Milena Código: 2151795

4. Hernández Mejía Karen Andrea Código: 2110569

5. Sánchez Méndez Lizeth Daniela Código: 2190876

*El presente taller se debe entregar a mano, a lapicero y en grupo de máximo 5 personas

En base a lo impartido en clase y al material suministrado, por favor conteste las siguientes
preguntas:

1. El bromuro de etidio se utiliza habitualmente para:

a) Hibridación molecular
b) Proceso de amplificación del ADN
c) Detección de productos de PCR
d) Extracción de ácidos nucleicos
e) Ninguna de las anteriores

Justificación: El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA

intercalándose entre los pares de bases, por lo que es usado como aclarador de ácidos nucleicos
en procesos como la electroforesis en gel de agarosa. Éste actúa como una sonda inespecífica que
emite luz fluorescente de color rosado-anaranjado cuando se irradia en la parte UV del espectro,
permitiendo así la detección de los productos de PCR [ CITATION Cor04 \l 9226 ].

2. El proceso de detección de un agente infeccioso por PCR se desarrolla de manera habitual

en tres etapas:
a) Extracción y purificación de los ácidos nucleicos del paciente, amplificación de un
segmento específico del genoma del paciente y detección de los fragmentos amplificados
por electroforesis en gel de agarosa
b) Extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microrganismo, amplificación de un
segmento específico del genoma del microrganismo y detección de los fragmentos
amplificados por electroforesis en gel de agarosa
 c) Extracción y purificación de los ácidos nucleicos del paciente, amplificación de un
segmento específico del genoma del paciente y detección de los fragmentos amplificados
por fluorescencia
d) Extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microorganismo, amplificación de un
segmento específico del genoma del microorganismo y detección de los fragmentos
amplificados por fluorescencia
e) Las respuestas a y b son ciertas

Justificación: Se puede evidenciar las tres etapas; en primer lugar se realizó una extracción de
ADN de las células exfoliadas de la muestra, después, con una PCR en tiempo real cuantitativa se
realizó la detección de ADN de diferentes microorganismo (VHS 1 y 2, M. hominis, M. genitalium,
U. urealyticum y C. trachomatis); se realizó una amplificación del gen L1 de VPH, utilizando los
cebadores GP5+ y GP6+, este último marcado con biotina para obtener productos, que al ser
hibridados con oligosondas complementarias del genotipo viral, permite la detección mediante
quimioluminiscencia [ CITATION Leó16 \l 9226 ]

3. En la PCR en tiempo real la detección de los productos amplificados:

a. Se lleva a cabo simultáneamente con la amplificación
b. Se lleva a cabo mediante electroforesis en el gel de agarosa
c. Se lleva a cabo por hibridación molecular en filtro de nitrocelulosa
d. No es necesaria
e. Ninguna de las respuestas anteriores es cierta

La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo
paso, al correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad
de fluorescencia. Posee características importantes como alta especificidad, amplio rango de
detección (de 1 a 107 equivalentes genómicos de la secuencia blanco)[ CITATION Bre01 \l 9226 ] y
rapidez en la visualización del producto ya que no es necesario realizar una electroforesis
posterior. Los ensayos de la PCR en tiempo real son entre 10,000 y 100,000 veces más sensibles
que las pruebas de protección por ARNasa,1 1,000 veces más sensibles que la hibridación por Dot
blot 2 y pueden detectar diferencias de una sola copia del ADN [ CITATION Won05 \l 9226 ]

4. Una ventaja importante de la PCR en tiempo real con respecto a la PCR convencional es:
a. Posibilidad de usar un solo cebador para la reacción de amplificación
b. Menor riesgo de contaminación
c. Menor coste
d. Mayor especificidad
e. Ninguna de las anteriores es correcta

En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera

simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior, lo que conlleva a
que el riesgo de contaminación disminuya de forma muy importante, mientras que en la PCR de
tipo convencional, la fuente de contaminación más común son los fragmentos de ADN
amplificados previamente en el laboratorio (amplicones) que pueden contaminar reactivos,
superficies y materiales y producir resultados falsos positivos y para disminuir el riesgo de
contaminación hay que tomar y respetar rigurosamente una serie de precauciones de diversa
índole, que incluyen una distribución del laboratorio en distintas áreas de trabajo (pre y post-PCR),
la adopción de tediosos hábitos de trabajo que minimizan el riesgo, el uso de material especial o el
empleo de sistemas anticontaminación, como la irradiación de superficies y reactivos con luz
ultravioleta o los sistemas químicos como la isopsoralina o la uracil-Nglucosilasa (UNG) [ CITATION
Cos04 \l 9226 ]

5. Las técnicas de amplificación génica (PCR/PCR en tiempo real) presentan una alta
sensibilidad, por tanto, el riesgo de contaminación cruzada entre muestras es
considerable. Para determinar la presencia de contaminaciones en la reacción de
amplificación para el diagnóstico de un agente etiológico, se recomienda:
a. Montar muestras positivas como controles
b. Montar muestras negativas como controles
c. Montar agua como control
d. Las respuestas a y b son ciertas
e. Las respuestas b y c son ciertas

El control negativo de una PCR se trata de una muestra en la que se incluyen todos los
componentes de la reacción, excepto el DNA. Éste contiene un volumen de agua y se utiliza para
comprobar que ninguno de los componentes de la reacción está contaminado con DNA de otra
procedencia y que no se han producido errores de manejo que hayan provocado la contaminación
cruzada entre muestras [ CITATION Pér \l 9226 ].

6. Indique 5 aplicaciones de la PCR:

i. Clonación directa a partir de ADN genómico o ADNc
ii. Análisis de la presencia de agentes infecciosos
iii. Diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas
iv. Análisis de variaciones de secuencias alélicas
v. Secuenciación directa de nucleótidos de ADN genómico y ANDc [ CITATION Coe06 \l 9226 ]

7. Mencione 2 importantes diferencias entre las técnicas de PCR y PCR en tiempo real:
i) En la PCR de tiempo real amplifica y simultáneamente cuantifica de forma absoluta el
producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Mientras que el PCR
convencional solo amplifica, y para su cuantificación se debe llevar a cabo el proceso
de electroforesis.
ii) El PCR convencional tiene menor precisión, especificidad y mayor riesgo de
contaminación que el PCR de tiempo real, debido la variabilidad que se introduce en la
cuantificación y que conlleva a errores en la estimación derivada de la integridad del
ADN, la eficiencia enzimática y otros muchos factores [ CITATION Coe06 \l 9226 ]
[ CITATION Kre08 \l 9226 ].
 8. El sistema de detección por fluorescencia empleado en la PCR en tiempo real puede ser de
dos tipos:
a. Agentes intercalantes como: fluorocromos como SYBR Green, bromuro de etidio y
Eva Green [ CITATION Fer14 \l 9226 ]
b. Sondas específicas como: TaqMan, molecular beacons y FRET [ CITATION Cos04 \l
9226 ]

Cuál sistema es más específico, justifique su respuesta:

9. El sistema más específico tal como lo indica su mismo nombre es el de LAS SONDAS
ESPECIFICAS, ya que trabajan mediante hibridación, lo que garantiza especificidad en la
detección y permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales [ CITATION Cos04 \l
9226 ]

10. La PCR en tiempo real ofrece una plataforma ideal para la identificación y cuantificación de
agentes infecciosos de interés clínico. En el caso de Mycobacterium tuberculosis, bacteria
que crece muy lentamente en medios de cultivo. ¿Cuál cree usted que es la mayor utilidad
de esta técnica?, justifique su respuesta:

Las técnicas de PCR en tiempo real permiten identificar y cuantificar el producto amplificado en el
momento en que se está produciendo la reacción utilizando marcadores fluorescentes. La PCR
tiene mayor sensibilidad que la del cultivo tradicional y además de la simplificación máxima del
procedimiento, la mayor utilidad de ésta técnica es la rapidez en la obtención de resultados, pues
en el caso de Mycobacterium tuberculosis, la rapidez en la instauración del tratamiento resulta ser
clave en la evolución posterior de la enfermedad [ CITATION Cod10 \l 9226 ].

Bibliografía
x

1. Cortazar A, Silva E. Métodos físico químicos en biotecnología. [Online].; 2004 [cited 2019 Junio
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2. León D, Silva R, Ili C, Mieville S, Guzmán P, Briceño G, et al. Detección molecular de agentes
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