Nombre y apellido del alumno: Javier Ignacio Gambini

Fecha de envío: 15/06/2020

Tema de la monografía: Tema nº1-Diagnóstico virológico de COVID-19.

Este trabajo enumerará y describirá métodos de diagnóstico virológico para SARS-COV-2.

Centrándose en técnicas moleculares, solo describirá la clínica para comentar el diagnóstico
diferencial entre COVID-19 y Dengue, por considerarse una problemática relacionada.

Para la redacción de esta monografía se ha buscado información en distintos medios oficiales,

escritos y audiovisuales.

Técnicas de diagnóstico virológico:

Las reacciones se describirán ordenadamente según sean métodos:

1) Directos: Estudios que identifican al agente infeccioso o sus moléculas.

2) Indirectos: Estudios que evidencian la respuesta inmuno-específica del huésped.

La Organización Mundial de la Salud (WHO) recomienda utilizar distintas muestras

dependiendo de la gravedad de la enfermedad.(19)

La mayoría de papers consultados utilizan hisopado nasofaríngeo y orofaringeo. Existe

generación de falsos negativos por recolección precoz (previo a los 3 días siguientes al inicio de
síntomas) en este tipo de muestra. (3)

1) Métodos Directos:

Los más utilizados serían RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) y
variantes. (7,16,19)

1.1) RT-PCR: Técnica que utiliza una transcriptasa inversa generando ADN complementario
(ADNc) a partir de ARN, y luego amplifica dicho ADNc con una polimerasa termoestable. La
amplificación ocurre en una serie de ciclos donde la variación de temperatura permite la
separación de las hebras, el apareamiento de cebadores y la síntesis por acción de la polimerasa.
El ADNc amplificado puede ser visualizado mediante corrida electroforética y tinción. También
pueden fijarse fragmentos del material genético sobre membranas y visualizarse por medio de
hibridación con sondas, aumentando la sensibilidad de la técnica. Además existe la
cuantificación en fase acuosa, también por sondas. Detecta genes virales, por lo que permite
diagnóstico de COVID-19 en pacientes que aún no han desarrollado inmunidad, y en
inmunodeficientes. Posee un control interno de amplificación (material genético no relacionado
con la muestra de estudio presente en el mismo tubo) que disminuye los falsos negativos.
(7,11,18,19)

1.2) RQ-PCR: Otros documentos nombran la real-time RT-PCR (RQ-PCR). Es una variante de
RT-PCR que cuantifica el material genético durante su amplificación. Se acopla la reacción ya
descripta a un lector de fluorescencia, agregando compuestos intercalantes fluorescentes, o
sondas de hibridación específicas marcadas con fluorocromos. Entre las sondas hay tres tipos:
de hidrólisis, tipo “faros moleculares”, y FRET. (8,11,16,17,18)

1.3) Nested RT-PCR: Menos mencionada que las anteriormente descriptas. Variante de RT-
PCR, consiste en una doble amplificación del material genético (ADNc). Durante la segunda
amplificación, se utilizan cebadores internos resultando en amplificación específica de algunas
regiones. Esto le otorga mayor sensibilidad y especificidad que la RT-PCR común. Es
especialmente útil en muestras con baja carga viral. (16,18)
 1.4) RT-LAMP: CONICET y Fundación Pablo Cassará desarrollaron el “NEOKIT-COVID 19”
basado en el método “Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle acoplada a Transcriptasa
Inversa” (RT-LAMP). Es un método de amplificación de secuencias ARN que utiliza una
transcriptasa inversa, cebadores internos (inner primers), cebadores externos (outer primers),
ADN Polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra, y se incuba a temperatura
constante. La transcriptasa inversa sintetiza (a partir de ARN) ADNc, al cual se unirán primers
internos formando un bucle. Este bucle permite la unión de los cebadores externos y la
polimerasa, comenzando la replicación. La secuencia simple-cadena obtenida de esta primera
etapa servirá de templado para las posteriores replicaciones. Al final de la reacción se obtienen
varias copias de la secuencia blanco, que forman estructuras tallo-bucle. Presente en solución
hay colorante Azul de hidroxinaftol que vira de lila a azul durante la amplificación. El viraje
sucede por disminución de concentración de Mg2+ con el aumento de pirofosfatos producidos
durante la polimerización. El límite de sensibilidad es de 12,5 copias de genoma, y no se
produce reacción cruzada con posibles contaminantes. Esto le confiere alta sensibilidad y
especificidad. La reacción ocurre en 60 minutos. Los desarrolladores del kit remarcaron algunas
ventajas sobre RT-PCR, como no precisar un termociclador. También destacaron que no se
requiere personal altamente entrenado para la interpretación de los resultados, y que los
reactivos son menos costosos que los requeridos para RT-PCR.

La principal desventaja es la necesidad de purificar la muestra previamente, requiriendo

personal calificado y un laboratorio con cabina de bioseguridad. Como desventaja comparando
con RT-PCR, esta tiene control de amplificación interno, mientras que “NEOKIT-COVID-19”
utiliza tubos de control positivo con secuencias genómica de SARS-COV-2, y tubos de control
negativo. Este tipo de monitoreo no es tan preciso como el de RT-PCR. (4,6,9,12)

Tabla 1: Composición cuali-cuantitativa NEOKIT-COVID-19 (6)

1.5) FET-Biosensor: Este método no convencional se lista con los directos porque detecta
partículas virales. Corea del Sur desarrolló este biosensor basado en transistor de efecto de
campo (FET). El “COVID-19-FET-sensor” contiene anticuerpos específicos para glicoproteína
“spike” del SARS-COV-2 funcionalizados a una capa de grafeno. Detecta partículas virales
utilizando muestras sin purificar, lo cual simplifica el proceso de detección. Su límite de
detección es de 242 partículas/mililitro.(1,13)

Ilustración 1:COVID-19-FET-SENSOR (13)

2) Métodos Indirectos:

2.1) ELISA: El CONICET y el Instituto Leloir desarrollaron un test serológico llamado

“COVIDAR-IgG” que detecta inmunoglobulinas anti-SARS-COV-2. Es un Análisis por
enzimas ligadas a inmunoadsorbentes (ELISA) indirecto. Utiliza antígenos adsorbidos a una
superficie para adherir anticuerpos específicos de la muestra. De haber Inmunoglobulinas
específicas, quedan adheridas. Tras un lavado, se incuban con conjugados de anticuerpos anti-
inmunoglobulinas humanas unidos covalentemente a enzimas marcadoras. Tras otro lavado se
incuban con sustrato enzimático. El producto es coloreado o fluorescente y se mide su
intensidad, proporcional a la concentración de anticuerpos. Presenta poca utilidad para
detección temprana, pero mucha para confirmación en pacientes convalecientes, evaluar la
extensión de la pandemia, y realizar estudios de cinética. (5,18)

Diagnóstico diferencial:

Existe mimetismo entre Dengue y COVID-19. El Dengue puede presentar síntomas (fiebre,
mialgias y prurito) también señalados en COVID-19. En estas situaciones el Dr. Orduna plantea
orientarse hacia COVID-19 ante signosintomatología respiratoria (inusual en Dengue), hasta
confirmación por métodos moleculares. (10, 11, 14, 15)

Conclusiones:

Según la bibliografía consultada RT-PCR sería la técnica con mayor sensibilidad y

especificidad. RQ-PCR otorgaría ventajas por resultados en menor tiempo, aunque carece de
controles de amplificación internos y su costo es más elevado.

RT-LAMP otorga ventajas por su requerimiento de equipos simples, menor tiempo de reacción,
menor costo y producción local. Aún con menor sensibilidad que RT-PCR y sus variantes,
probablemente sea la mejor opción disponible para Argentina durante esta situación sanitaria y
económica.

“COVID-19-FET-sensor” sería muy útil en estudios de “screening”, al analizar muestras sin

purificar con alta sensibilidad y especificidad.

El kit “COVIDAR-IgG” supone gran utilidad para estudios estadísticos y epidemiológicos.

 La cantidad limitada de kits diagnósticos obliga su utilización de forma racional. Descartar
enfermedades que mimeticen signosintomatología (como Dengue) con pruebas específicas,
disminuiría el uso fútil de pruebas para COVID-19, haciendo la clínica indisociable del
diagnóstico virológico.

Bibliografía:

1-Biotech magazine & news. Sitio web. Por José M. Fernández-Rúa “Nuevo biosensor
diagnostica coronavirus en un minuto.”

2-“Clinical course and outcome of 107 patients infected with the novel coronavirus, SARS-
CoV-2, discharged from two hospitals in Wuhan, China” Dawei Wang, Yimei Yin, Chang Hu,
Xing Liu, Xingguo Zhang, Shuliang Zhou, Mingzhi Jian, Haibo Xu, John Prowle, Bo Hu,
Yirong Li and Zhiyong Peng. Doi: 10.1186/s13054-020-02895-6

3-Comunicación personal con Dra. Beck Gabriela, jefa de laboratorio “Hospital Prof. Dr. R.
Carrillo” (Ciudadela).

4-CONICET. Sitio web. Por Faigón,Miguel “Aprueban el uso de un nuevo test rápido y
económico de diagnóstico de COVID-19”

5-CONICET. Sitio web. “Investigadores argentinos logran desarrollar el primer test serológico
de país para el nuevo coronavirus SARS-COV-2”

6-CONICET, Fundación Pablo Cassará, Instituto de ciencia y tecnología “Dr. Cesar Milstein”.
“Manual A4 COVID NEOKIT CASSARA”

7-“COVID-19 Experience in a Private Institution in Buenos Aires During the First Month of the
Pandemic: 26 Cases”. Pedro Wainer, Federico Saavedra, Valeria Tagliapietra, Daiana Abeledo,
Daniela Migliore, Pablo Lapadula, Daniel Pryluka, Gonzalo Lopez Macchi, Eduardo Diez,
César Gnocchi. PMID: 32442932

8-“Current Status of Epidemiology, Diagnosis, Therapeutics, and Vaccines for Novel

Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)” Dae-Gyun Ahn, Hye-Jin Shin, Mi-Hwa Kim, Sunhee
Lee, Hae-Soo Kim, Jinjong Myoung, Bum-Tae Kim, and Seong-Jun Kim.
https://doi.org/10.4014/jmb.2003.03011

9-“Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays

Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)” Gun-Soo Park,
Keunbon Ku, Seung-Hwa Baek, Seong-Jun Kim, Seung Il Kim, Bum-Tae Kim, Jin-Soo Maeng.
DOI: 10.1016/j.jmoldx.2020.03.006

10- Ministerio de Salud. Página web, entradas “coronavirus-COVID-19” y “dengue”

11-“Manual de virología humana aplicada.” Quarleri, Jorge; Gomez Carrillo, Manuel. Editorial:
La Librería de la Ciencia.

12-“Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA” Tsugunori Notomi,Hiroto Okayama,

Harumi Masubuchi, Toshihiro Yonekawa, Keiko Watanabe, Nubuyuki Amino, Tetsu Hase.
https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63

13-“Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2) in Human Nasopharyngeal

Swab Specimens Using Field-Effect Transistor-Based Biosensor” Giwan Seo, Geonhee Lee, Mi
Jeong Kim, Seung-Hwa Baek, Minsuk Choi, Keun Bon Ku, Chang-Seop Lee, Sangmi Jun,
Daeui Park, Hong Gi Kim, Seong-Jun Kim, Jeong-O Lee, Bum Tae Kim, Edmond Changkyun
Park, Seung Il Kim. DOI: 10.1021/acsnano.0c02823
14-“SARS-CoV-2 Causing Pneumonia-Associated Respiratory Disorder (COVID-19):
Diagnostic and Proposed Therapeutic Options” C. Chakraborty, A.R.Sharma, G.Sharma,
M.Bhattacharya, S.S. Lee. DOI:10.26355/eurrev_202004_20871

15-Sociedad Argentina de Infectología. Canal de youtube. Video “Comité de Asesores

presidenciales de SADI.” Particularmente se cita al Dr. Orduna Tomás, Médico Infectólogo.
Jefe del Servicio de Patologías Regionales y Medicina Tropical (CEMPRA-MT). “Hospital de
Infecciosas Francisco J. Muñiz”.

16- “The COVID-19 Pandemic: A Comprehensive Review of Taxonomy, Genetics,

Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control” Yosra A. Helmy, Mohamed Fawzy, Ahmed
Elaswad, Ahmed Sobieh, Scott P. Kenney and Awad A. Shehata.

17-“The epidemiology, diagnosis and treatment of COVID-19” Pan Zhaia, Yanbing Dinga, Xia
Wub, Junke Longc, Yanjun Zhongd, Yiming Lie.
https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.105955

18-“Virología médica.” Carballal, Guadalupe; Oubiña, José Raúl. Editorial: Corpus.

19-WHO. “ Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human
cases” y “Pruebas de laboratorio para el nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) en casos
sospechosos de infección en humanos: orientaciones provisionales, 17 de enero de 2020”