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DIAGNOSTICO DE INFECCIONES CON TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Dra. Elizabeth Palavecino Rosales Profesor Auxiliar, UDA Laboratorios Clnicos.

Las ventajas de las tcnicas moleculares ha sido ampliamente publicitadas en los ltimos 7 aos, lo que sin duda ha aumentado la presin en los laboratorios clnicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas, genticas, oncolgicas y neurolgicas. Actualmente existe una variedad de paquetes comerciales, especialmente en el rea de las enfermedades infecciosas, que contienen todo lo necesario para realizar un examen, lo que obviamente ha estimulado a los laboratorios a incluir tcnicas de biologa molecular en el diagnstico clnico. Sin embargo, y como veremos ms adelante, estos mtodos moleculares no estn exentos de problemas tanto en su ejecucin como en su interpretacin, por lo que debieran estar reservados para aquellos laboratorios con personal familiarizado con estas tcnicas y que tengan la infraestructura necesaria para su realizacin.

Tcnicas o mtodos usados en biologa molecular En general, las tcnicas ms usadas son las de deteccin directa por hibridacin, usando un segmento de ADN marcado, y las tcnicas de amplificacion. Estas ltimas han tenido una verdadera explosin en su metodologa, como lo demuestra el que en la actualidad existan por lo menos seis tcnicas diferentes, aunque todas tienen como finalidad la amplificacin de un segmento de ADN o ARN que ha sido seleccionado como un marcador para una determinada patologa. En este artculo me referir al uso de estas tcnicas en el diagnstico de enfermedades infecciosas basada en la experiencia personal. Sin embargo, es

importante notar que los fundamentos de las tcnicas descritas a continuacin son similares en la mayora de los exmenes usados para diagnstico clnico.

HIBRIDACION POR SONDAS Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas, sustratos antignicos, quimioluminiscencia o radioispotos, los que se pueden unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria de cido nucleico. Estas sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o ARN seleccionado, que puede tener de veinte a miles de bases de largo. Las sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucletidos y pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad por instrumentos comerciales actualmente disponibles. Las sondas de oligonucletidos tienen la ventaja de hibridar ms rpidamente a las molculas blanco (target) y pueden, bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un nucletido dentro de una secuencia de cido nucleico. Existen varias condiciones que afectan el proceso de unin o hibridacin entre la sonda y el segmento blanco, como temperatura, concentracin de sal y pH de la reaccin. Por ejemplo bajas concentraciones de sal y altas temperaturas permiten que slo el segmento blanco se una a la sonda, miestras que, por el contrario, si la temperatura de la reaccin es baja, segmentos no complementarios pueden unirse a la sonsa. Por lo tanto, las condiciones deben ser cuidadosamente controladas para evitar falsos positivos. La deteccin de la hibridacin puede hacerse de varias maneras, dependiendo del mtodo usado para marcar la sonda. Por ejemplo, si se usa una enzima, la hibridacin se puede visualizar por un cambio de color y si se usa quimioluminiscencia, por emisin de luz un luminmetro. Indicaciones para el uso de sondas o probes en el laboratorio. Las pruebas de hibridacin a menudo disminuyen el tiempo necesario para identificar organismos fastidiosos. Adems, permiten que los laboratorios puedan aumentar el nmero de patgenos que pueden ser identificados. En el estudio de costos, debe considerarse que aunque los exmenes que usan sondas son ms caros que los mtodos tradicionales, el hecho de tener un resultado en un mnimo de tiempo puede significar un ahorro para el paciente y el hospital. Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una muestra clnica (expectoracin, orina, etctera) o para confirmar la identificacin de un cultivo que por otros mtodos tarda varios das (Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etctera). Adems, las sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para evaluar la respuesta del

husped a un agente infecciosos en particular y tambin para determinar la extensin de la infeccin mediante el estudio de muestras de tejidos de varios rganos. La Tabla 1 enumera algunos de los exmenes con sondas disponibles comercialmente. Muchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y slo se diferencian en la secuencia a la cual est dirigida la sonda.

TABLA 1 EJEMPLOS DE ORGANISMOS QUE PUEDEN SER DETECTADOS POR MEDIO DE SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS DISPONIBLES COMERCIALMENTE. Tipo de prueba Deteccin directa de la muestra Organismo Bacterias

Streptococci grupo A Legionella pneumophila Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrheae Tricomonas vaginalis

Virus

Papiloma humano

Confirmacin de cultivo

Bacteria

Enterococci Streptococci grupo B Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Neisseria gonorrhoeae Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium Otras especies de mycobacteria

Hongos

Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatidis Coccidioides immitis

Virus

Papiloma humano

TECNICAS DE AMPLIFICACION Las tcnicas de hibridacin pueden tener una baja sensibilidad debido a que en algunos casos existe una sola copia de la secuencia en blanco. Por esta razn las tcnicas de amplificacin, que pueden producir millones de copias de un determinado segmento de ADN o ARN, han tenido un impacto extraordinario en muchas reas del diagnstico clnico. Como fu mencionado anteriormente, existen varias tcnicas de amplificacin las cuales varan ligeramente en su mtodo de amplificacin. Unas de las tcnicas de amplificacin ms usadas en la actualidad, tanto elaboradas en el propio laboratorio como comercialmente, es la reaccin de la polimerasa en cadena o PCR. Otra tcnica que ha sido evaluada para el diagnstico es la reaccin de la ligasa en cadena o LCR, en la cual pequeos segmentos amplificados son posteriormente ligados. Ambas tcnicas se encuentran disponibles comercialmente y pueden ser adquiridas en varios formatos de automatizacin. Otras tcnicas de amplificacin, la mayora sin nombre traducido al espaol, son strand displacement amplificatin (SDA), isothermal RNA self sustaining sequence replication. reaction, nucleic acid sequencebased amplification (TMA) y la amplificacin por QB replicasa. A continuacin slo se analizarn los fundamentos de las tcnicas de PCR en el diagnstico de enfermedades infecciosas, que el anlisis de las otras escapa al objetivo de esta revisin.
Definicin y componentes de la PCR

Esta tcnica es una amplificacin enzimtica in vitroque resulta en una acumulacin de la secuencia blanco (target). La PCR consiste de un nmero de ciclos cambios de temperatura que producen:

separacin de las hebras de ADN; unin del oligonucletido (partidor o primer) al segmento ADN; extensin que permite a la ADN polimerasa sintetizar el resto de la hebra complementaria.

Estos ciclos se repiten habitualmente 30 40 veces para obtener un producto que puede ser fcilmente detectado por medio de un gel de agarosa o por hibridacin en microplacas. Con esta tcnica, practicamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin

embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicacin clnica que podra tener la deteccin de un determinado organismo, as como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparacin con las tcnicas tradicionales. En general, las tcnicas de diagnstico molecular estn indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos perodos de incubacin. Un organismo que cumple los requisitos descritos es el Mycobacterium tuberculosis y es por ello que existen numerosas tcnicas de amplificacin disponibles comercialmente, algunas de ellas aprobadas por la oficina de Administracin de Drogas y Alimentos (FDA) en EE.UU. La sensibilidad de estos exmenes en expectoracin vara de 85 a 95% y la especificidad entre 95 y 97%. Otros organismos que pueden ser detectados directamente de una muestra clnica mediante tcnicas de amplificacin comerciales son Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Candida, Tricomonas, virus VIH, virus herpes, virus hepatitis C, enterovirus y virus papiloma. Actualmente se encuentran en evaluacin exmenes de amplificacin para una variedad de otros organismos. La Tabla 2, enumera los exmenes de PCR que actualmente se ofrecen para diagnstico de enfermedades infecciosas en el laboratorio clnico de la Universidad Catlica.
TABLA 2 ORGANISMOS QUE PUEDEN SER DETECTADOS POR AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS EN EL LABORATORIO DEL HOSPITAL DE LA UNIVERSIDAD CATOLICA Organismos Mycobacterium tuberculosis Bordetella pertussis Chlamydia trachomatis Virus herpes simplex 1 y 2 Virus hepatitis C Virus HTLV 1 Pneumocystis carinii Interpretacin Tipos de muestras Expectoracin, lavado broncoalveolar, LCR, tejido,orina, lquido articular y peritoneal Aspirado nasofarngeo Orina, secrecin uretral, secrecin y vaginal LCR, sangre, lesin cutnea Sangre Sangre Lavado broncoalveolar, aspirado nasofarngeo

Debido a la alta sensibilidad de estos exmenes, la interpretacin es en algunos casos dficil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todava ser amplificado. Adems, la presencia de un organismo en una

determinada muestra no siempre significa infeccin. Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinacin de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo. Falsos positivos debido a contaminacin. Uno de los problemas ms graves que enfrenta las tcnicas de amplificacin para su aplicacin en diagnstico, es la falsa positividad debido a la contaminacin con cidos nucleicos, la que puede provenir de tres frecuentes: de otras muestras clnicas que contienen un nmero elevado se secuencias blanco (contaminacin entre muestras), de la contaminacin de reactivos, por amplificaciones anteriores y la ms grave de todas, de la acumulacin de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia. Por estas razones, los laboratorios que usan tcnicas de amplificacin deben tener normas estrictas de control de calidad. El Comit Nacional de Normas de Laboratorio Clnico de USA tiene un documento de regulacin provisorio que es bastante especifico .En nuestro pas no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mnimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el procesamiento de la muestra y otro para la amplificacin y tener adems el personal adecuado para realizar estas tcnicas.

CONCLUSIONES A pesar del innegable poder de las tcnicas de biologa molecular en el diagnstico clnico, es errneo pensar que van a reemplazar a los exmenes convencionales para deteccin de agentes patgenos. Sin embargo, la capacidad de estas tcnicas para proporcionar un diagnstico definitivo en corto tiempo tendr sin duda, un efecto en el manejo del paciente y nos ayudarn a entender mejor la patognesis de la infeccin. Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los microorganismos, las tcnicas de diagnstico molecular tendrn un mayor impacto en algunos patgenos. Es as que exmenes rpidos para la identificacin de Micobacterias y la deteccin de resistencia a las drogas de primera lnea, dar la base para que se tomen ms oportunamente las decisiones clnicas adecuadas. Tambin, la identificacin rpida de virus Herpes simplex en el LCR de un paciente con encefaliitis dar la oportunidad de comenzar oportunamente la terapia adecuada, eliminando otros procedimientos ms invasivos.

A medida que se automaticen, con un costo menor y con regulaciones ms precisas, los laboratorios clnicos podrn incorporar estos exmenes en el funcionamiento de rutina y los clnicos podrn familiarizarse an ms con la interpretacin y con las ventajas que proporcionan las tcnicas de biologa molecular en el diagnstico clnico.

Mtodos de biologa molecular Reaccin de polimerasa en cadena El mtodo de PCR se basa en ciclos de amplificacin exponencial de un fragmento especifico de ADN. Este fragmento est determinado por secuencias introducidas en la reaccin, denominadas "partidores", y a partir de los cuales la enzima ADN polimerasa, realiza la sntesis exponencial (Figura 2). Cada ciclo de amplificacin consta de tres etapas: denaturacin, alineamiento y extensin. La denaturacin se realiza a 95o C y la separacin conseguida permitir que cada hebra sirva como molde o templado para la sntesis de una nueva molcula de ADN. El tiempo de denaturacin depende del largo del templado, y generalmente dura entre 30 segundos y 1 minuto. Debido a que al comienzo de la amplificacin es necesario separar todo el ADN de la muestra analizada, inicialmente se realiza una incubacin de 5 minutos a 95o C por una sola vez. Despus de la denaturacin sigue la etapa de alineamiento entre el ADN templado y los partidores. Esta etapa se basa en el principio de la renaturacin de Doty et al 8 ya que ocurre al llevar la reaccin a 45o C - 60o C. Sin embargo, dado que los partidores estn en mayor concentracin que el templado, se favorecer el alineamiento entre templado: partidor por sobre templado: templado. El ADN doble hebra formado (templado: partidor) definir el sitio de accin de la ADN polimerasa o extensin, etapa en la cual esta enzima unir nucletidos libres en forma complementaria a la secuencia del templado. La extensin ocurre a 72o C que es la temperatura de mxima eficiencia de la enzima y el tiempo de la extensin depender de la distancia de los partidores entre s. En general se ha calculado que la ADN polimerasa es capaz de incorporar 60 nucletidos por segundo a 70o C,15 por lo que un minuto es tiempo suficiente para incorporar alrededor de 1.000 pares de bases. Ya que se ocupan dos partidores en la reaccin, uno para cada hebra, y que estos quedan a una distancia de entrecruzamiento durante la sntesis de ADN, el segmento definido ser amplificado en forma exponencial (Figura 2). Esto significa que en cada ciclo de amplificacin se producir una nmero de copias equivalente al exponente del nmero de hebras de ADN templado. As por ejemplo, si al momento de iniciarse la amplificacin slo hay una molcula de ADN doble hebra (2 templados), despus de 30 ciclos de amplificacin se habrn generado 230 copias de ADN. Este nmero corresponde a 1,097,736,000 copias del segmento flanqueado por los partidores. El elemento mas crtico de la amplificacin por PCR es el alineamiento. Dado que este fenmeno se basa en la complementariedad entre las bases nitrogenadas del templado y del partidor, sta es una unin alterada por varios factores, entre otros la temperatura (Figura 3). La figura muestra el impacto de la variacin de 5o C con relacin a la cantidad de templado en la especificidad de la reaccin. La importancia de la amplificacin por PCR en Infectologa se basa en que con esta magnitud de amplificacin es posible el anlisis de molculas de ADN o ARN, a partir de mnimas cantidades de muestras. As por ejemplo, si consideramos que una bacteria contiene 1 fg (10-9 g) de ADN, la amplificacin por PCR permitir generar alrededor de 0,1 g (10-6 g) de una regin especifica de ADN bacteriano. En la prctica, este mtodo permite identificar secuencias presentes entre 10 y 50 copias en una muestra clnica y sin condiciones especiales de mantencin. Aunque la PCR permite

la amplificacin de cidos nucleicos, la visualizacin del producto amplificado requiere de otras metodologas posteriores a la amplifi-cacin. El mtodo ms utilizado es la electroforesis de agarosa, tcnica descrita por Southern 12 en el que el producto, sometido a corriente elctrica, migrar de acuerdo a su tamao. Sin embargo, este es un mtodo indirecto, porque slo indica el tamao del amplificado. La visualizacin directa requiere de mtodos que "lean" la secuencia del amplificado. Entre estos mtodos estn cortes con enzimas de restriccin, hibridacin con sondas especficas (Southern-blot) o secuenciacin del producto de PCR. El corte con enzima de restriccin consiste en incubar el producto con enzimas de restriccin que reconozcan secuencias palindrmicas dentro del producto amplificado y luego visualizarlo por electroforesis. Despus de la digestin se observarn dos fragmentos, los que sumados equivaldrn al fragmento del producto sin digestin. La hibridacin con sondas es el ms utilizado en los kitscomerciales y aunque tradicionalmente consiste en la tcnica de Southernblot, en los mtodos comerciales se utiliza el formato ELISA, en el que la sonda esta fijada en los pocillos de la microplaca (Figura 4). La secuenciacin (ver ms adelante) slo se ocupa como mtodo de referencia. Uno de los mayores problemas de la amplificacin por PCR es la inhibicin, esto porque existen numerosos factores que anulan la actividad de la ADN polimerasa.16 En general la proporcin de inhibicin reportado es de alrededor del 5%, sin embargo, esta vara desde 3% para muestras de sangre perifrica hasta 18,5% para muestras de anatoma patolgica (tejido fijado en formalina e incluido en parafina) (Tabla 2). Una variacin y automatizacin de la PCR es la amplificacin en tiempo real o LightCycler System. Esta tecnologa desarrollada en 199617, 18 se basa en la emisin de fluorescencia durante la extensin de la ADN polimerasa,19 lo cual permite el monitoreo continuo en cada ciclo de amplificacin (Figura 5). Dado que la cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de amplificacin, este mtodo es ideal para la cuantificacin de ADN y ARN. Adems una vez generado el producto, es posible monitorear su secuencia dado que la cintica de denaturacin / renaturacin del producto es secuencia dependiente y por lo tanto no son necesarios mtodos adicionales para su visualizacin.19 En este mtodo tambin es posible introducir sondas especficas para confirmar el producto amplificado lo cual aumenta su especificidad. Dado que este sistema utiliza tubos capilares, cada etapa de amplificacin es significa-tivamente ms corta que en la amplificacin convencional, reduciendo el tiempo total de amplificacin a slo 30 minutos. 20

Figura 3. Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la reaccin de polimerasa en cadena. La amplificacin se realiz para citomegalovirus (100 copias) en tres condiciones de alineamiento (63, 65 y 68 C). Se observa que a mayor temperatura desaparecen las amplificaciones inespecficas, quedando slo la banda especfica de citomegalovirus.

Figura 4. Hibridacin en microplaca tipo ELISA. Este mtodo de confirmacin de la reaccin de polimerasa en cadena se basa en etapa 1: unin de la sonda marcada con biotina (B) al pocillo de ELISA a traves de streptoavidina (S), etapa 2: hibridacin, del producto amplificado marcado con digoxigenina (D) a la sonda, etapa 3: inmunodeteccin del producto amplificado por anticuerpos antidigoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (E) y etapa 4: revelado, en el que se agrega un sustrato el cual precipita generando un color que es visualizado por lectura espectrofotomtrica. (Cortesa BIOS-Chile I.G.S.A.)

Amplificacin isotrmica La amplificacin isotrmica consiste en convertir, en forma cclica, una molcula de ARN a ADN doble hebra y a partir de ella, realizar la transcripcin a ARN, el cual sirve de templado para un nuevo ciclo de amplificacin21,22(Figura 6). En la amplificacin isotrmica se requieren dos partidores, que definen el ARN mensajero a amplificar, y uno adems contiene una secuencia denominada "promotora" para la enzima que realiza la transcripcin (ARN polimerasa). Adems de la ARN polimerasa participan otras dos enzimas, la transcriptasa reversa y la ARNasa H (Figura 6). Este mtodo slo amplifica ARN y su principal aplicacin clnica est en el diagnstico de agentes infecciosos23,24 y la cuantificacin de la carga viral de virus ARN (VHB, VHC y VHI).25,26 La cuantificacin de ARN se realiza coamplificando el ARN de la muestra en forma conjunta con calibradores internos o ARN de concentracin conocida y se mide mediante electroquimio-luminiscencia.27 Tabla 2. Inhibiciones en amplificacin por reaccin de polimerasa en cadena

Figura 5. Mtodo de amplificacin en tiempo real. Este sistema se caracteriza por la presencia de una sonda doblemente marcada en 5` con un fluorforo de reporte y en 3` con un fluorforo de ocultamiento (etapa 1). Durante la extensin, la ADN polimerasa hidroliza esta sonda liberando el fluorforo de reporte (etapa 2). La cantidad de fluorforo liberado es proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado.

Figura 6. Mtodo de amplificacin isotrmica. En este mtodo, el proceso comienza con la hibridacin entre el ARN en estudio y el partidor 1, que contiene el sitio promotor para la ARN polimerasa (etapa 1). A partir de esta hibridacin, la transcriptasa reversa genera una hebra simple de ADN, denominado ADN copia (cADN), creando un hbrido ARN: cADN (etapa 2). El ARN de este hbrido es degradado por la ARNasa H, quedando el

cADN hebra simple, el cual se une al partidor 2 (etapa 3). A partir de este partidor y por accin de la transcriptasa reversa se produce la hebra complementaria generando ADN doble hebra. A partir del sitio promotor contenido en el partidor 1, se realiza la transcripcin a ARN por la ARN polimerasa (etapa 4) generando mltiples templados de ARN, los cuales son utilizados como templados para repetir el proceso.

Hibridacin de ADN ramificado (Branched DNA) La metodologa de hibridacin con ADN ramificado o branched DNA (bDNA) se basa en hibridaciones consecutivas de sondas que reconocen por una parte la secuencia de ADN o ARN en estudio y por otra, secuencias introducidas a la reaccin para amplificar la seal de hibridacin (Figura 7).28 En este mtodo la visualizacin del ADN blanco no depende de un proceso enzimtico, como en la reaccin de polimerasa en cadena, sino de la amplificacin de la seal de hibridacin. Esta metodologa es altamente reproducible y se utiliza clnicamente en la cuantificacin de carga gnica en pacientes portadores del VIH, VHB y VHC.30, 31 cDNA microarray La tecnologa de cDNA microarray se basa en la incorporacin en un chip, similar al utilizado en computacin, de 5.000 a 8.000 sondas que representan la totalidad de los genes expresados por un microorganismo.32,33 De este modo se puede identificar los patrones de expresin bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiolgicas o patolgicas. El principio de cDNA microarray es la hibridacin, pero a diferencia de los mtodos tradicionales, se utilizan mltiples sondas, las que unidas a un sistema cuantitativo de anlisis, permiten identificar patrones de expresin gnica.33 Esta metodologa, aunque an se encuentra a nivel experimental, tiene una proyeccin tan importante en clnica como la PCR.

Figura 7. Mtodo de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificacin de cidos nucleicos. El proceso comienza con la hibridacin de las sondas de captura a una fase slida. A continuacin se produce la reaccin de hibridacin entre las sondas de captura y el ADN o ARN en estudio, lo cual es seguido de la introduccin de la sonda de amplificacin que contiene mltiples sitios para las sondas de revelado. Estas ltimas estn conjugadas con molculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN o ARN hibridado.

Figura 8. Potenciales aplicaciones clnicas de la secuenciacin de genomas de microorganismos

Secuenciacin Los mtodos de secuenciacin permiten "leer" el cdigo gentico de un microorganismo. Las principales aplicaciones de la secuenciacin en Infectologa estn en la identificacin de nuevos patgenos, la caracterizacin de brotes epidmicos y la identificacin de patrones genticos que determinan la resistencia a terapia.34 Especficamente, la resistencia de la transcrip-tasa reversa y proteasa a

frmacos antivirales en pacientes VIH,35 resistencia a ganciclovir en citomegalovirus36 y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis,37 son algunas las aplicaciones clnicas ms importantes de la secuenciacin. Finalmente la secuenciacin ha permitido conocer el genoma completo de microorganismos tales como Neisseria menin-gitidis,38M. tuberculosis,39 Clostridium perfringens,40 Streptococcus pyogenes41 y Helicobacter pylori.42 La posibilidad de analizar el genoma completo de micro-organismos est permitiendo estudiar las interacciones microorganismo-husped y con la ayuda de herramientas computacionales (bioinformtica) desarrollar nuevos agentes teraputicos y vacunas.43