EVALUACIÓN CINÉTICA DE LA ENZIMA PECTINA METILESTERASA (PME -

EC 3.1.1.11) OBTENIDA DE NISPERO (ACHRAS SAPOTA L.) PARA SU

APLICACIÓN AGROINDUSTRIAL.

INTEGRANTES:
JESÚS NUÑEZ
LUIS SALCEDO
RAMÓN GONZÁLES
ANDRÉS NUÑEZ
ANGELICA ARIAS
ALEJANDRA HOYOS

PRESENTADO A:
MSc. KATHERINE BARRAGÁN VILORIA

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
SINCELEJO-SUCRE

DICIEMBRE 2020
 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En Colombia existe una gran diversidad frutícola, representada en especies nativas y

exóticas. El níspero común, Achras sapota L., originario de centro y Sudamérica, es uno de
las especies, con más potencialidades agroindustriales, debido a sus características físico
químicas, organolépticas y nutricionales (Pajajoy et al., 2003). El níspero común, que para
muchos es desconocido y subutilizado por otros, crece en huertos caseros y áreas boscosas.
En Colombia se cuenta con producciones que cubren el mercado interno, el cual está
representado en el consumo del fruto en fresco (pulpa) principalmente y en menor proporción
se utiliza para preparar jugos, sorbetes, helados y mermeladas (Garzón et al., 2019).

El níspero es un fruto considerado no climatérico y por ello se recolecta una vez ha madurado
en el árbol, posee una textura frágil y de gran actividad enzimática, lo que lo hace muy
susceptible a daños mecánicos y bioquímicos en su etapa de postcosecha. El período de vida
útil tras la recolección es muy corto, como consecuencia de su alta susceptibilidad a la
pérdida de agua, el pardeamiento de la pulpa y el ataque por hongos. Estos problemas
influyen significativamente en las altas pérdidas postcosecha, que pueden llegar a ser
superiores al 25% de la producción (Gisbert et al., 2007).

La pérdida de firmeza, aunque necesaria para lograr el máximo desarrollo sensorial, es uno
de los factores que más contribuye con el deterioro del fruto, disminuyendo así su calidad
(Carabali et al., 2009). El ablandamiento ocurre debido a los cambios en la pared celular,
siendo los más significativos los relacionados a sus componentes durante la maduración,
como la concentración de las sustancias pécticas solubles en agua, las cuales aumentan
ocurriendo paralelamente un descenso de los polisacáridos (celulosa, hemicelulosa y
sustancias pécticas), debido a la solubilización de las pectinas; proceso atribuido
generalmente a la acción de enzimas, entre las que se encuentra la pectina metilesterasa PME
EC. 3.1.1.11 (Rodríguez y Restrepo, 2011).

Pregunta de investigación:

¿Podría extraerse la enzima pectina metilesterasa PME de frutos de níspero de variedad

Achras sapota L., y aplicarse en procesos agroindustriales?
 JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

El níspero, es un fruto muy apetecido por su aroma y agradable sabor, siendo muy utilizado
para la elaboración de jugos, mermeladas y jaleas (Carabali et al., 2009). Tiene utilidades
tanto ornamentales como frutales: es principal fuente del chicle en México y América
Central. Su látex se aprovecha en la industria, pero su uso principal es como fruta fresca. Se
cultiva en las regiones cálidas de Colombia principalmente los departamentos del Bolívar,
Atlántico y Córdoba, sin embargo, pueden encontrarse cultivos esporádicos de huerta casera
en el valle del Cauca, la costa Pacífica y los llanos orientales (Monterroza y Sánchez, 2005;
Minagricultura, 2011).

Según un reporte del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, en Colombia en el año

2017 se produjeron 457 toneladas de níspero en las 53 hectáreas de área cosechada,
presentando un rendimiento nacional de 8,56 t/ha (MINAGRICULTURA, 2020). Los
principales departamentos productores del fruto son Bolívar (43,8%), Atlántico (33,2%) y
Córdoba (23%) con mayor participación nacional (MINAGRICULTURA, 2011).
En Sucre la producción de frutales solo se maneja como cultivo de patio, y en esta zona no
existen cultivos comerciales de esta fruta, siendo uno de los factores que incide esta situación
el desconocimiento de métodos de propagación eficaces y tecnificación en el cultivo (Toro,
2004). A pesar de las ventajas económicas que genera la producción de este frutal, el níspero
en el departamento de Sucre solo se maneja como cultivo de huerta casera, su utilización solo
se limita al consumo de su fruta en fresco y degustarlo en jugos (ICA, 2007).
Estos aspectos ofrecen un panorama general sobre la importancia de abrir un campo de
investigación y mostrar el aprovechamiento agro-industrial de este fruto. Una alternativa es
la de aprovechar la desventaja en postcosecha que presentan los cultivos de níspero por la
sobre maduración del fruto, tomando aquellos que no estén aptos para su comercialización
por la baja calidad en su textura y perdida de firmeza, y emplearlos en procesos de extracción
de la enzima pectina metilesterasa PME, la cual presenta múltiples aplicaciones industriales.
En base a lo anterior es importante ofrecer una técnica que permita extraer la enzima de los
tejidos del fruto, manteniendo su integridad estructural y catalítica, para su posterior análisis
cinético que nos permita identificar las condiciones óptimas de trabajo de la enzima. Con
esto se pretende contribuir en el desarrollo agroindustrial del departamento y el país,
proporcionándole a los campesinos y organismos empresariales alternativas para darle valor
agregado a la materia prima con la que cuenta la región y que hasta el momento no ha sido
explotada a escala comercial.
 MARCO TEORICO

NISPERO
El níspero (Achras sapota L.) también llamado en otras regiones chico, chicozapote, níspero
o chiku pertenece a la familia Sapotaceae, la cual se caracteriza por la presencia de látex en
todas las partes vegetativas y aún en los frutos antes de madurar, es una especie tropical, la
mayoría arbórea, utilizadas por los frutos o las resinas extraídas del tronco, incluye entre 37
a 75 géneros y cerca de 800 especies (Gisbert et al., 2007). Es un árbol de tamaño variable,
de 5 a 20 metros de altura, originario de México y Centroamérica, se encuentra ampliamente
distribuido en el trópico sur de Florida y Bermudas hasta Brasil incluyendo las islas
Antillanas, además ha sido introducido a las regiones tropicales de Asia, África y Oceanía
(Gutiérrez et al., 2010)

El fruto del níspero (Figura 1), es una baya colgante de forma ligeramente redondeada,
ovalada, elipsoidal carnosa y dulce cuyo tamaño puede variar de 3 a 8 cm de largo y 3 a 6
cm de diámetro, generalmente contiene de 3 a 6 semillas semi aplastadas de color negro
brillante (García, 2013). La piel, aunque dura, se puede pelar fácilmente cuando el fruto está
maduro, es de color marrón oscuro, cubierta por un polvillo que le da una textura áspera y
rugosa. El color de la pulpa puede variar según el cultivar y puede ser marrón, amarillento o
rojizo (Gariglio et al., 2002).

Figura 1. Frutos de níspero (Achras sapota L.).

El níspero, una fruta tropical que nace principalmente en las zonas cálidas del país, un
fruto con múltiples beneficios como vitamina A, vitamina B, minerales, potasio,
magnesio, hierro y calcio. Además, contiene fibra soluble (pectinas), taninos, sustancias
de acción astringente y numerosas sustancias aromáticas como los ácidos orgánicos
(cítrico, tartárico y málico) abundantes en su pulpa (Hogarmania, 2011). En el país se
conocen dos clases de nísperos: el japonés con un fruto de forma ovalado y amarillo, y el
níspero costeño, generalmente redondo, carnoso y de color café. Este último es el
utilizado en la gastronomía caribeña colombiana, pues es apreciado por su carne firme y
jugosa, con sabor acidulado, con actividades de ayuda digestiva, astringente y depurativa
(Garzón et al., 2019). La floración ocurre en diferentes épocas, por lo general aparecen
poco a poco durante un largo período, lo que da como resultado que hay producción
durante casi todo el año, con los mayores índices entre junio y noviembre
(Minagricultura, 2011).

DISTRIBUCION

El níspero es nativo de Centro y Sur América, específicamente de la península de Yucatán

de México, y se ha extendido por todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo.
Tiene las mayores bases comerciales en la India, México, Filipinas, Shri Lanka, Malasia,
Venezuela, Guatemala, las Bahamas, Bermudas y en el interior de los valles de Palestina
(Mickelbart, 2002). El cultivo es muy extenso en la india, donde se estiman plantaciones
de 2000 ha, mientras que en México hay 1511,5 ha dedicado a la producción del fruto y
4000 ha para la extracción de chicle (Monterroza y Sánchez, 2005).

En Colombia se estima una producción anual de 457 t de níspero en las 53 ha de área

cosechada, presentando un rendimiento nacional de 8,562 t/ha (MINAGRICULTURA,
2020). Los principales departamentos productores del fruto son Bolívar (43,8%),
Atlántico (33,2%) y Córdoba (23%), presentando rendimientos de 10 t/ha, 5,85 t/ha y 15
t/ha, respectivamente.

Fuente: Minagricultura 2020

 COMPONENTES BROMATOLOGICOS

Estos componentes hacen relación al valor nutricional de la fruta, el cual está constituido
por agua, proteína, grasa, carbohidratos, fibra, minerales, entre otros (Tabla 1).
Tabla 1. Componentes nutricionales de la corteza, pulpa y semilla del fruto de níspero
común (Achras sapota L.).

Análisis Cascara Pulpa Semilla

Análisis proximal (g/100 g muestra fresca)
Humedad 74.29 78.14 41.24
Materia seca 25.71 21.86 58.76
Proteína 0.78 0.47 3.32
Grasa 0.04 0.06 0.58
Fibra 0.31 0.46 6.54
Cenizas 0.61 0.56 1.64
Carbohidratos 24.28 20.77 53.22
Análisis mineralógico ppm (mg/Kg muestra fresca)
Fosforo 102.84 65.58 822.64
Potasio 3573.69 2464.14 4700.8
Calcio 437.07 284.18 1997.84
Magnesio 359.94 218.6 881.4
Azufre 205.68 109.3 822.64
Sodio 1285.5 983.7 2644.2
Boro 1.276 0.636 3.208
Cubre 0.617 0.349 2.821
Hierro 54.41 7.61 182.39
Magnesio 2.88 2.27 11.05
Zinc 2.78 2.28 10.11

Fuente: Pajajoy et al. (2003). Valores obtenidos en laboratorios de CORPOICA.

La pulpa de níspero común presenta ventajas considerables, tanto para consumo en fresco,
como para uso agroindustrial, por sus excelentes características organolépticas, físico
químicas y nutricionales, por lo cual, esta especie puede ser considerada de alto valor
potencial.
MADURACION DEL NISPERO
El níspero es un fruto considerado no climatérico y por ello se recolecta una vez ha madurado
en el árbol, posee una textura frágil y de gran actividad enzimática, lo que lo hace muy
susceptible a daños mecánicos y bioquímicos en su etapa de postcosecha. El período de vida
útil tras la recolección es muy corto, como consecuencia de su alta susceptibilidad a la
pérdida de agua, el pardeamiento de la pulpa y el ataque por hongos (Gisbert et al., 2007).

La pérdida de firmeza, aunque necesaria para lograr el máximo desarrollo sensorial, es uno
de los factores que más contribuye con el deterioro del fruto, disminuyendo así su calidad
(Carabali et al., 2009). El ablandamiento ocurre debido a los cambios en la pared celular,
como la solubilización de las pectinas, proceso atribuido generalmente a la acción de enzimas
hidrolíticas, entre las que se encuentra la pectina metilesterasa (PME) (Pérez y Carpita, 2006;
Rodríguez y Restrepo, 2011). Las PME tienen por función, durante la maduración de los
frutos, la desesterificación del grupo carboxilo de los restos de ácido poligalacturónico y
como consecuencia incrementar la susceptibilidad de las pectinas al ataque de las
poligalacturonasas. En síntesis, la hidrólisis de las sustancias pécticas constitutivas de la
pared celular de los frutos, es la causa fundamental de su ablandamiento de éstos durante la
maduración (Díaz et al., 1997; Pérez y Carpita, 2006).

PECTINA Y PECTAMETILESTERASA-PME-
Las pectinas se caracterizan por ser un grupo heterogéneo de polisacáridos ricos en ácido
galacturónico que conforman hasta un 35% de la pared celular primaria de frutos de
dicotiledóneas y monocotiledóneas. En particular, las pectinas pueden presentar
modificaciones importantes que les permiten tener un papel crítico en las propiedades
biomecánicas de la pared celular influyendo sobre su porosidad, permeabilidad y elasticidad,
entre otras (Willats et al., 2006).

El principal componente de la pectina es el homogalacturonano, que consta de residuos de α-

β- ácido galacturónico unidos por un enlace α-1,4 glicosídico. Los grupos carboxilo de los
residuos de ácido galacturónico pueden esterificarse por metilo y la enzima PME cataliza la
desmetilesterificación de unidades de ácido galacturónico de pectina, generando grupos
carboxilo libres y liberando protones (Christensen et al; 2001).

La PME ejerce su efecto sobre las pectinas (sustrato), modificando las propiedades de estos
compuestos al remover el grupo metilo del ácido galacturónico (Fig.2). La pectina desmetil
esterificada es el sustrato de las poligalacturonasas (PGs), que hidrolizan el enlace α-1,4 del
ácido y promueven su degradación (Salazar y Gamboa, 2013).
 Figura 2. Forma de acción de la PME sobre las sustancias pécticas. (Tomado de Micheli,
2001).
La PME transforma la pectina soluble en ácido pectínico y después en ácido péctico (piruvato
de metoxilo) con el fin de que ésta catalicé la saponificación de los metoxilos y liberé alcohol
metílico (Johansson, 2002). Cataliza la hidrólisis de grupos metilo de los monómeros de
ácido galacturónico provocando la liberación de metanol, pectinas de bajo metoxilo y ácidos
pécticos por unión a moléculas de calcio . La reacción tiene lugar por el ataque nucleofílico
del enzima sobre el enlace éster, dando lugar al acil-enzima y a la liberación de metanol.
Posteriormente, la hidrólisis del intermediario libera el enzima y la pectina con un grupo
carboxílico libre. Cuando las PME actúan aleatoriamente sobre los homogalacturonanos, la
demetilesterificación libera protones que promueven la acción de endopoligalacturonasas y
contribuyen al ablandamento de la pared celular (Menéndez, 2006).

PME en frutos de níspero

En un estudio realizado en frutos de níspero Manilkara zapota var. Prolific por Bedoya (2002)
se encontró que una de las enzimas hidrolíticas de la pared que juega un rol muy importante
en el ablandamiento del níspero es la PME, por lo cual purificó parcialmente la PME y
determinó que la actividad de la enzima es muy alta en el estado de madurez fisiológica,
constituyéndose ésta en un índice bioquímico para ese estado de desarrollo. Se determinó la
máxima actividad de la PME de 0,16 μmol acido/mg.min. También se realizó la
caracterización cinética encontrándose una Km aparente de 0,04 μg/μL y una Vmáx aparente
de 0,8235 μmol, acido/min.

El pH óptimo fue estimado entre 3 y 4, y al realizar los ensayos sobre la temperatura óptima
de reacción de la PME de nísperos se determinaron dos picos de máxima actividad, uno a 10
°C y otro a 50 °C, con valor de absorbancia de 0,99. La tendencia general para la actividad
residual de la PME es la de ser termorresistente, es decir, su actividad no es inhibida por el
calor, sólo se reduce en poca proporción, ya que a 100 °C seguía manteniendo el 83,72% de
su actividad.
IMPORTANCIA DE LA PME
La PME juega un papel muy importante en el procesamiento industrial de frutos y vegetales.
En el procesamiento de pulpa de tomates, naranjas, y otros rubros, así como en la
clarificación de jugos y bebidas, se debe aplicar un calentamiento rápido para inactivar la
PME o se aplican inhibidores enzimáticos para así mejorar la calidad organoléptica del
producto (Marquis y Bucheli, 2003).

Se emplea la PME en la industria como estabilizadores de turbidez de jugos o néctares de

frutos cítricos, suele agregarse a la pectinasa y una proteasa vegetal (papaína, bromelina), la
cual contribuye al desdoblamiento del pectato de calcio (Bajard et al., 2006).
Como clarificante de jugos y néctares, la adición de preparados de pectina metilesterasa,
generalmente en conjunto con celulasas (0,05-0,5 g/l), conocidas como "enzimas filtrantes o
clarificantes", degradan las sustancias pécticas, permitiendo realizar filtraciones rápidas para
obtener jugos claros, sin obstruir los poros del filtro, evitando cambios en los jugos por
fenómenos de oxidación que ocurren en las 25 filtraciones lentas. Este proceso de
clarificación se realiza generalmente en diversas fases: a) reducción de la viscosidad, pero
sin cambio de opalescencia; b) floculación o decantación y disminución de la opalescencia,
y c) eliminación de la pectina y obtención rápida de un filtrado claro (Bajard et al., 2006).

Para el incremento en la extracción de jugos, se aplica la PME con el objeto de lograr un

mayor rendimiento en jugo a partir de algunas frutas que no se pueden prensar con facilidad,
quedando retenida una cantidad apreciable de jugo. Así sucede en las uvas para obtener el
mosto, lo que trae, además, como ventaja, que los vinos resultantes adquieren mejor aroma,
al haberse degradado las sustancias pécticas; también aumenta la extracción del colorante de
la uva (Maturano et al., 2009).
 OBJETIVO GENERAL
Evaluar cinéticamente la enzima pectina metilesterasa (PME – EC 3.1.1.11) obtenida a partir
de pulpa de níspero (Achras sapota L.) para su uso a nivel agroindustrial.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Establecer un método de extracción y purificación de la enzima PME a partir de pulpa de

níspero (Achras sapota L.).

 Caracterizar cinéticamente la enzima PME obtenida de la pulpa de níspero y las

condiciones óptimas de trabajo.

 Aplicar la enzima en una matriz alimentaria (bebida) para determinar su funcionalidad

en la agroindustria.
 METODOLOGIA
Objetivo 1: Establecer un método de extracción y purificación de la enzima PME a partir de
pulpa de níspero (Achras sapota L.).

EXTRACCIÓN
El primer paso para la purificación y el posterior análisis cinético de las enzimas, es su
extracción de frutos de níspero en estados de madurez fisiológica, con técnicas que permitan
mantener su integridad, estabilidad estructural y actividad catalítica. Se empleará la
metodología realizada por Bedoya et al., (2014) en la cual evaluaban cinco métodos de
extracción de PME en níspero Manilkara zapota [L.] variedad Prolific, por lo cual,
tomaremos como base el mejor método (Fig. 3). Además, con este método se pudo evitar la
interferencia que ocasiona la presencia de látex en los frutos de níspero y en el menor tiempo
(2 horas).

Maceración de la pulpa

Pulverizar la muestra con N2L y suspender en 20 ml de Tris-

HCl (0,1 M -pH 8)

Centrifugar a 10.000 rpm por 30

min.

Filtrar sobrenadante en lana de

vidrio

Almacenar a -20 °C

Figura 3. Esquema de la secuencia y las técnicas utilizadas para realizar la extracción de la

PME a partir de pulpa de níspero. Tomado de Bedoya et al., (2014).
La aplicación del N2L y del Buffer Tris-HCl permiten la solubilización de la PME, la cual se
encuentra en la pared celular. Otra propiedad que ofrece el uso del N2L es neutralizar el efecto
del látex presente en la pulpa, aspecto muy importante porque la presencia del látex afecta la
extracción, la actividad y el proceso de purificación (Bedoya, 2002).
PURIFICACIÓN
Se realizará la precipitación de las proteínas con sulfato de amonio (NH4)2SO4 de acuerdo a
la metodología planteada por Guadarrama y Rivas (1990) con algunas modificaciones (Fig.
4). El sulfato de amonio, es muy soluble en agua y no tiene ningún efecto nocivo sobre la
actividad enzimática.

Mezclar sulfato de amonio solido (NH 4)2SO4 con la proteína

Dejar en reposo 30 min a 4 ºC.

Centrifugar a 10000 rpm x 30 min

Separar sobrenadante del pellet

Agregar 1000 μL de Buffer Tris 0,1 M

Centrifugar a 10000 rpm x 10 minutos

Separar pellet y almacenar a -20 °C

Figura 4. Precipitación de las proteínas. Tomado de Guadarrama y Rivas (1990)

Objetivo 2: Caracterizar cinéticamente la enzima PME obtenida de la pulpa de níspero y las

condiciones óptimas de trabajo.
Determinación de la actividad de la pectina metilesterasa (PME): Para determinar la
actividad de la enzima PME se aplicará la metodología de Hagerman y Austin (1986), la cual
se fundamenta, en un ensayo colorimétrico haciendo uso de un espectrofotómetro. La
metodología consiste en realizar una mezcla de reacción con la enzima PME, el sustrato
(pectina) y 20 µL de azul de bromofenol. Cuando la PME desmetila la cadena de ácido
poligalacturónico se acidifica el medio, este cambio en el pH genera un cambio en la
coloración del azul de bromofenol, de azul a amarillo. Este cambio es captado por el
espectrofotómetro y se mide la actividad de forma indirecta como un cambio en la
absorbancia a 620 nm.
Determinación de las constantes cinéticas: Una vez culminado el proceso de purificación
de la enzima, se procederá a realizar la determinación de los parámetros cinéticos Vmax y
Km de la PME. Se determinará la actividad enzimática de acuerdo al método
espectofotométrico de Hagerman y Austin (1986) con variaciones en las concentraciones de
sustrato, pectina cítrica (5, 4, 3, 2, 1, 0.5%), pH (2, 4, 6, 8, 10, 12) y temperatura (10, 20, 30,
40, 50, 60). Experimentalmente se establecerá un grupo control, el blanco y los grupos
experimentales con tres repeticiones de cada uno, con el fin de determinar las condiciones
óptimas de concentración de sustrato, pH y temperatura de trabajo.

Estabilidad de las enzimas al calor: Este procedimiento tiene la finalidad de medir la

actividad residual de la enzima después de haber sido sometida a altas temperaturas por
tiempos variables (Cameron y Grohmam, 1995). Luego se procederá a medir la actividad
enzimática residual, de acuerdo a la metodología planteada por Hagerman y Austin (1986),
considerando la concentración, temperatura y pH óptimos obtenidos en esta investigación.

Diseño estadístico: Se realizará un diseño experimental multifactorial categórico analizado

mediante el programa Statgraphics Centurion XVI. Los factores a evaluar incluyen las
variaciones en las concentraciones de sustrato, pectina cítrica (5, 4, 3, 2, 1, 0.5%), pH (2, 4,
6, 8, 10, 12) y temperatura (10, 20, 30, 40, 50, 60), con tres repeticiones para cada ensayo.
Posteriormente se realizaron los Análisis de Varianza y Pruebas de Medias correspondientes.

Objetivo 3: Aplicar la enzima en una matriz alimentaria (bebida) para determinar su

funcionalidad en la agroindustria.

Teniendo en cuenta la importancia industrial de las enzimas pectinasas en la clarificación de

jugos y bebidas, se evaluará el efecto clarificante de la enzima PME obtenida a partir de la
pulpa de níspero (Achras sapota L.) en jugo de tamarindo (Tamarindus indica L.), siguiendo
la metodología propuesta por Román (2020), quien en su investigación empleó enzimas
pectinasas extraídas de la guayaba (Psidium guajava L.) en jugo de tamarindo.
Se realizará un diseño experimental multifactorial analizado mediante el programa
Statgraphics Centurion XVI. Los factores a evaluar son la concentración adecuada de enzima
en el jugo (%) y tiempo de acción catalítica (minutos).

Se realizará un análisis bromatológico y fisicoquímico siguiendo los métodos AOAC (2005)

para cuantificar el contenido de proteína, grasa, ceniza, fibra y pH del jugo de tamarindo. Se
determinarán las propiedades reológicas con un reómetro Modular Compact Rheometer
MCR 302, el cual se encuentra en disposición en la planta piloto de la Universidad de Sucre
(Lobato et al., 2014). Se empleará un colorímetro para medir los parámetros instrumentales
de color (Román, 2020). Se realizará una valoración sensorial mediante una escala hedónica
midiendo el grado de aceptación en los atributos del producto (Pacheco et al., 2004).
Finalmente se evaluará la estabilidad durante el almacenamiento del jugo de tamarindo
empacado en botellas PET siguiendo la metodología propuesta por Román (2020) por un
periodo de dos meses, analizando cada tres sus propiedades sensoriales.

REFERENCIAS
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