Cinética

Enzimática
I
Concurso para cargo de auxiliar docente de 2°
categoría - Química Biológica I - FBQF - UNT

Benjamín J. Bertini
 Introducción

Substrato Productos Cinética

Enzimática
Estudio de la velocidad de
reacciones catalizadas por
enzimas y cómo diferentes
parámetros experimentales
pueden modificarla.
Enzima Complejo Enzima - Sustrato Enzima

La actividad de una enzima (μmol S ó P / min) está

determinada por la velocidad de la reacción que
cataliza. Se calcula midiendo Formación de producto
o Consumo de Sustrato por unidad de tiempo
 Objetivos:
¿Condiciones experimentales?
¿Velocidad inicial?
01
2
Evaluar cómo afectan las
Integrar conocimientos sobre condiciones experimentales a la
actividad enzimática para velocidad de una reacción
comprender por qué se debe
enzimática
trabajar en condiciones de
velocidad inicial para determinar las
constantes cinéticas ¡Curvas de
Tiempo!

Establecer con los resultados las Resultados Realizando Curvas de Tiempo

condiciones experimentales 3 de la reacción catalizada por la
adecuadas para trabajar en enzima ureasa de soja.
condiciones de velocidad inicial

TP: Cinética II → Determinación de parámetros cinéticos y efecto de

inhibidores
01
Introducción
El modelo de Michaelis-Menten y la velocidad inicial
Velocidad inicial
V0 Velocidad inicial: Cuando la formación de
producto (o consumo de sustrato) de la
reacción es directamente proporcional al
tiempo de reacción..

Se debe trabajar siempre en condiciones de

V0 (velocidad inicial) para aplicar el
modelo.

Parámetros
cinéticos
V0: Velocidad inicial
VMAΧ: Velocidad máxima alcanzada para dada
[ES]
KM:Constante de Michaelis-Menten
01

Velocidad inicial
La concentración de producto varía
linealmente con el tiempo

La velocidad inicial es constante y la

mayor alcanzada en esas condiciones

Determinación de velocidad inicial: cantidad de enzima fija con [S] en exceso y

condiciones definidas de pH y Temperatura. Se mide el producto formado a distintos
tiempos y se grafica una Curva de tiempo (P=f(t)).
 Curva de tiempo para la ureasa de Soja
NH3

Se determinará la formación de producto (NH3) a lo largo de la reacción de la

hidrólisis de la urea catalizada por la enzima ureasa de soja para establecer la
actividad enzimática de la misma en distintas condiciones experimentales
(Temperatura, pH y concentración de enzima)
2
Factores experimentales que modifican la Velocidad de una
reacción enzimática:
Concentración de Sustrato
pH
Estudio dificultoso. Se trabaja
Afecta ionización de grupos
con [S] >> [E] para [S] ≈
funcionales
Constante

Temperatura
Afecta la energía cinética de
los reactantes

Concentración de
Enzima
Afecta la VMAX de la reacción
2
Trabajo experimental:
Determinar la actividad de la ureasa de soja, mediante curvas de tiempo, en distintas condiciones
experimentales, aplicando un método colorimétrico de punto final para medir el producto formado (NH3) -
Método de Berthelot-

Hacer una curva de calibración con concentraciones conocidas de NH3 para poder traducir las absorbancias
medidas en términos de concentración de producto formado por la enzima.

Establecer las condiciones experimentales apropiadas para el estudio de las constantes cinéticas de la enzima.

Reacciones que ocurren:

Nitroprusiato de Sodio
2
Grupos de trabajo

Distintos Buffers a
pH pH: 5 6 7 8
diferentes pH

Temp. Distintas temperaturas de T (°C): 0 37 60

incubación de la reacción 80

[E] Distintas diluciones del extracto

1 1 1 1
que contiene a la enzima 25 50 75 100
2
E Alícuota de 1 mL + 0,1 mL de Buffer
1 mL Urea Blanco
+ 9 mL Buffer B
(Sin Enzima)

1 mL+ Enzima
A los 20’
1 mL al tiempo: 0’ 5’ 10’ 15’ 20’
Añadir
React. A
E

Incubar a T
dada 1 2 3 4 5 B

2 mL de Reactivo A ya en los tubos 1-5 + 2 mL Reactivo B de berthelot

Incubar 10 min. a 37 °C
3
B 1 2 3 4 5 Medir Abs a λ540 nm Curva construida a partir de soluciones de
(NH4)2SO4 de concentraciones conocidas.

NH3

Para cada tiempo (en cada condición) se

obtiene la medida del producto
 3 NH3

V0

T(°C)
Muchas
gracias

Benjamín J. Bertini
2
Efecto del pH

La mayoría de las enzimas son proteínas, que poseen

grupos químicos ionizables. V0

Según el pH del medio estos grupos tendrán cargas

positivas, negativas o neutras.

La conformación tridimensional, y por lo tanto la función,

de las enzimas depende en parte de sus cargas eléctricas.

Al PH óptimo la conformación de la enzima será la más adecuada

para la catálisis (máximo en V0)
2
Efecto de la Temperatura

Un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de

reacción al incrementar la Ec y los choques efectivos entre
moléculas

Si la enzima absorbe demasiada energía en forma de calor,

se despliega la estructura tridimensional y se pierde la
actividad enzimática.

En la temperatura óptima es donde se observa la mayor actividad

catalítica
2
Efecto de la concentración de enzima

En condiciones saturantes de sustrato, toda la enzima está

formando el complejo ES

Aumentar la cantidad de enzima genera un aumento en la

VMAX mientras se mantengan las condiciones saturantes.
Luego la V0 determinada ya no es VMAX