ACTIVIDADES U7 - CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. Una suspensión de E. coli lactosa negativa y sensible a ampicilina,

tetraciclina, cloranfenicol se transforma con un vector recombinante,
obteniéndose una mezcla de bacterias no transformadas y transformadas con
el vector recombinante o con el vector no recombinante. Explica cómo
realizarías la selección e identificación de los clones recombinantes en los
siguientes supuestos:

a) El vector es un plásmido con un gen de resistencia a la ampicilina, un gen

de resistencia a la tetraciclina y un polylinker en el centro del gen de
resistencia a la ampicilina.

Ya que el polylinker se encuentra en el centro del gen de resistencia a la

ampicilina, en caso de que el ADN se inserte correctamente este gen dejará de ser
funcional. Es decir, al introducir el vector recombinante en las bacterias
obtenemos tres tipos de células:
- Células no transformadas, sensibles a la ampicilina y a la tetraciclina.
- Células transformadas con el vector no recombinante, que al no tener la
inserción que inhibe el gen serán resistentes a ambos antibióticos.
- Células transformadas con el vector recombinante, que al tener la inserción
serán resistentes a la tetraciclina y sensibles a la ampicilina.
Para realizar la selección, se siembran las bacterias en una placa con medio de
cultivo al que añadimos tetraciclina. En ella crecerán sólo las células
transformadas, que son las que tienen el gen de resistencia a la tetraciclina.
Después se hace presión sobre la placa con terciopelo estéril, para poder transferir
las colonias a una placa nueva en la que habrá también medio, esta vez con
ampicilina. En ella crecerán las células transformadas con el vector no
recombinante, que son las que conservan el gen de resistencia a la ampicilina
intacto. Las células transformadas con el vector recombinante no crecerán.
Por último, y teniendo en cuenta la posición de las colonias, se seleccionan las que
han crecido en el medio con tetraciclina pero no en el medio con ampicilina, ya
que éstas serán las que contienen el fragmento de ADN que nos interesa.
b) El vector es un BAC con un gen de resistencia al cloranfenicol, un gen letal
para la bacteria y un polylinker en el centro del gen letal.

Ya que el polylinker se encuentra en el centro del gen letal, en caso de que el ADN
se inserte correctamente este gen dejará de ser funcional. Es decir, al introducir el
vector recombinante en las bacterias obtenemos tres tipos de células:
- Células no transformadas, sensibles al cloranfenicol.
- Células transformadas con el vector no recombinante, que al no tener la
inserción morirán a causa del gen letal.
- Células transformadas con el vector recombinante, que al tener la inserción
no mueren a causa del gen y tienen resistencia al cloranfenicol.
Para realizar la selección se cultivan las bacterias en una placa con cloranfenicol.
Únicamente crecerán las células de interés, ya que las no transformadas son
sensibles al antibiótico y las transformadas por el vector no recombinante mueren
a causa del gen.

c) El vector es un cósmido con un gen de resistencia a tetraciclina, un gen

LacZ y un polylinker en el centro del gen de resistencia a la tetraciclina.

Ya que el polylinker se encuentra en el centro del gen de resistencia a la

tetraciclina, en caso de que el ADN se inserte correctamente este gen dejará de
ser funcional. Es decir, al introducir el vector recombinante en las bacterias
obtenemos tres tipos de células:
- Células no transformadas, sensibles a la tetraciclina.
- Células transformadas con el vector no recombinante, que al no tener la
inserción serán resistentes al antibiótico y que debido al gen LacZ son lac+.
- Células transformadas con el vector recombinante, que al tener la inserción
son sensibles al antibiótico y que debido al gen LacZ son lac+.
Para realizar la selección se cultivan las bacterias en un medio de cultivo con el
antibiótico, un inductor del operón lac (IPTG) y el sustrato cromogénico X-gal. En
estas condiciones, las bacterias lac+ producen colonias azules y las lac-, blancas.
Es decir, como resultado se obtendrán colonias blancas (no transformadas) y
colonias azules (transformadas). Respecto a las colonias azules distinguimos entre
las que poseen el vector no recombinante, que crecerán porque poseen el gen de
resistencia al antibiótico, y las que poseen el vector recombinante, las cuales no
crecerán puesto que el fragmento de ADN de interés se ha insertado en medio
del gen anteriormente mencionado.
Para concluir, seleccionaremos las colonias azules que no han crecido.
d) El vector es un plásmido con un gen de resistencia a la ampicilina, el gen
que codifica para la GFP y un polylinker en el centro del gen GFP.

Ya que el polylinker se encuentra en el centro del gen GFP, en caso de que el ADN
se inserte correctamente este gen no se expresará y no emitirá fluorescencia. Es
decir, al introducir el vector recombinante en las bacterias obtenemos tres tipos
de células:
- Células no transformadas, sensibles a la ampicilina.
- Células transformadas con el vector no recombinante, que al no tener la
inserción presentarán fluorescencia verde y serán resistentes al antibiótico.
- Células transformadas con el vector recombinante, que al tener la inserción
no presentan fluorescencia y serán resistentes al antibiótico.
Para realizar la selección se cultivan las bacterias en un medio de cultivo con el
antibiótico. Por tanto, sólo crecerán las células transformadas por un vector.
Para distinguir las que poseen el fragmento de ADN de interés, se ilumina la placa
de Petri con luz UV. Las colonias transformadas por el vector no recombinante
presentarán fluorescencia, mientras que las transformadas por el vector
recombinante no tendrán fluorescencia.
Seleccionaremos, por ende, aquellas que hayan crecido pero no presenten
fluorescencia verde.
2. Se ha transformado una cepa de E. coli sensible a la ampicilina y lactosa
negativa con un plásmido recombinante que tiene un gen de resistencia a la
ampicilina, un gen LacZ y un polylinker en el centro del gen de resistencia a la
ampicilina.
La transformación se realizó añadiendo 20 µL de una solución de plásmido
con una concentración de 0,03 µg/µL a 480 µL de suspensión bacteriana, para
un volumen final de solución de transformación de 500 µL.
A continuación se sembraron 25 µL de la suspensión de bacterias
transformadas en una placa control sin antibiótico y otros 25 µL en una placa
con ampicilina, X-gal e IPTG.
A las 24 horas de incubación, a 37º C, en la placa control crecieron 450 UFC y
en la placa con ampicilina y X-gal crecieron 30 colonias blancas y 120 colonias
azules.
Calcula:
a) La tasa de transformación.
b) La tasa de transformación recombinante.
c) El porcentaje de clones recombinantes respecto del total de clones
transformados.
d) El porcentaje de células transformadas respecto del total de células
presentes en la suspensión inicial.

𝑈𝐹𝐶 · 𝑉𝑡
a) Tasa de transformación = 𝐶 · 𝑉𝑠

C = 20 µL · 0,03 µg/µL = 0,6 µg de vector

150 · 500
Tasa de transformación = 0,6 · 25
= 5 · 103 células transformadas/ µg de vector

𝑛º 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑎𝑠 · 𝑉𝑡
b) Tasa de transformación recombinante = 𝐶 · 𝑉𝑠

30 · 500
Tasa de transformación recombinante = 0,6 · 25
= 103 células transformadas por el
vector recombinante/ µg de vector

30
c) % clones recombinantes = 150
· 100 = 20%

150
d) % células transformadas = 450
· 100 = 33,33%