EJERCICIOS UT 10.

CULTIVOS CELULARES

1. Se quiere hacer un pase de un cultivo en monocapa que está a punto de entrar en

confluencia.

Una vez despegadas y lavadas las células, se resuspenden en 5 ml de medio de cultivo. Para
hacer el recuento de viables, 20 µl de la suspensión se mezclan con 20 µl de azul tripán y con
la mezcla se carga una cámara de Neubauer. El recuento de las células blancas y azules en las
cuatro esquinas de la cámara (1-4) ha sido el siguiente:

1) 76 células blancas y 16 azules. 3) 72 células blancas y 16 azules.

2) 68 células blancas y 20 azules. 4) 64 células blancas y 12 azules.

a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml de suspensión? ¿Y la densidad celular viable?

El número total de células blancas en las cuatro esquinas es 76 + 68 + 72 + 64 = 280 El número

total de células azules en las cuatro esquinas es 16 + 20 + 16 + 12 = 64

El número total de células en las cuatro esquinas es 280 + 64 = 344

La densidad celular total = 344 · 2 · 104 / 4 = 1,7 · 106 células totales/ml

La densidad celular viable = 280 · 2 · 104 / 4 = 1,4 · 106 células viables/ml

b) ¿Qué viabilidad tienen las células (porcentaje de viables respecto del total)?

Viabilidad = 280 · 100 / 344 = 81,4 % (El 81,4% de las células de la suspensión son viables).

c) Las células se van a subcultivar en frascos roux de 25 cm 2 y se quieren sembrar 7 · 105

células por frasco en un volumen final de medio de 5 ml por frasco.
¿Cuántos frascos se necesitan?
¿Qué cantidad de medio y de suspensión celular hay que colocar en cada uno?

Como queremos sembrar 7 · 105 células viables en cada frasco nuevo, se necesitan 0,5 ml de la
suspensión celular. Como hay 5 ml de suspensión, sembraremos 10 frascos nuevos.

En cada frasco se colocarán 4,5 ml de medio de cultivo nuevo + 0,5 ml de la suspensión celular.

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2. Queremos congelar células de una línea celular que crece en suspensión. Partimos de una
suspensión de células lavadas y resuspendidas en 5 ml de medio de cultivo. Para hacer el
recuento de viables, se hace una dilución previa 1/10 de la suspensión con PBS. Después
se mezclan 20 µl de la dilución con 20 µl de azul tripán y con la mezcla se carga una cámara
de Neubauer. El recuento de las células blancas y azules en las cuatro esquinas de la
cámara (1-4) ha sido el siguiente:

1) 48 células blancas y 10 azules. 3) 44 células blancas y 12 azules.

2) 41 células blancas y 9 azules. 4) 47 células blancas y 11 azules.

a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml originales de la suspensión? ¿Y la

densidad celular viable?

El número total de células blancas en las cuatro esquinas es 48 + 41 + 44 + 47 = 180

El número total de células azules en las cuatro esquinas es 10 + 9 + 12 + 11 = 42 El número total

de células en las cuatro esquinas es 180 + 42 = 222

La densidad celular total = 222 · 2 · 10 · 104 / 4 = 11,1 · 106 células totales/ml

La densidad celular viable = 180 · 2 · 10 · 104 / 4 = 9 · 106 células viables/ml

(En este caso se multiplica también por 10 porque la suspensión original se diluyó 1/10 con PBS).

b) ¿Qué viabilidad tienen las células? (Porcentaje de viables respecto del total.)

Viabilidad = 180 · 100 / 222 = 81,1 % (El 81,1% de las células de la suspensión son viables).

c) Queremos congelar las células en criotubos a una densidad de 10 6 células viables/ml,

colocando 1,5 ml de suspensión en cada criotubo. Explica qué pasos seguirías desde la
suspensión de células en medio de cultivo hasta colocar los criotubos en nitrógeno
líquido. ¿Qué volumen de solución de congelación necesitas? ¿Cuántos
criotubos necesitas?

El número total de células viables en los 5 ml de suspensión es 9 · 106 · 5 = 45 · 106 células.

Para conseguir una densidad de 106 células viables/ml de solución de congelación, necesitamos
45 ml de solución de congelación.

Como en cada criotubo vamos a pipetear 1,5 ml, necesitamos 45/1,5 = 30 criotubos.

El proceso será el siguiente:

- Centrifugar la suspensión celular a 700-800 rpm y eliminar el sobrenadante.

- Resuspender las células en 45 ml de solución de congelación (suero + 10% de DMSO)

- Alicuotar, pipeteando 1,5 ml en cada uno de los 30 criotubos.

- Colocar los criotubos en congelador a –20ºC, 24 h.

- Colocar los criotubos en congelador a –80ºC, 24 h.

- Llevar los criotubos al tanque de nitrógeno líquido.

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3. Observa la figura a continuación y responde a las siguientes preguntas

a) ¿Cómo se llama el material en cuestión?

Rejilla de la cámara de Neubauer

b) ¿Para qué se emplea, en el cultivo celular?

Para realizar el recuento de células viables y no viables en un cultivo

c) Señala que zona se utiliza para llevar a cabo la función que describes en el apartado
b

(deben señalar los 4 cuadrados que presentan a su vez 16 cuadrados pequeños)

d) ¿Qué superficie tiene cada uno de los 9 cuadrados grandes?

1 mm x 1 mm = 1 mm2
e) Una vez introducida la muestra, ¿qué volumen supone cada uno de los cuadrados?

1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3